第七章 荧光免疫技术【参考】.pptVIP

* * * * * * * 基本原理：将抗原抗体反应与荧光物质发光分析相结合，用荧光检测仪检测抗原抗体复合物中特异性荧光强度，对液体标本中微量或超微量物质进行定量测定。 第四节 荧光免疫分析 荧光免疫测定的方法类型 非均相荧光免疫测定： 时间分辨荧光免疫测定、荧光酶免疫测定 均相荧光免疫测定： 荧光偏振免疫测定 时间分辨荧光免疫测定(TR-FIA) 基本原理：是用镧系稀土元素螯合物（如Eu3+）标记抗体或抗原，检测标本中的抗原或抗体。此螯合物具有较长荧光寿命，得用时间分辨荧光分析仪延缓测量时间，可排除标本中非特异性荧光的干扰，所得信号完全是稀土元素螯合物发射的特异荧光。 时间分辨检测原理示意图 自发荧光寿命短:1ns～10ns 镧系元素寿命长:10μs～1000μs 短寿命荧光完全衰变后再测定镧系 元素特异荧光 时间分辨荧光免疫测定（双抗体夹心法）示意图 方法评价和临床应用 灵敏度高：最小检出量10-18mol/L 标记物稳定：有效使用期长 测量快速，易自动化 易受污染，本底增高 因此,是很有发展前途的超微量物质免疫分析技术。 第五节 荧光免疫技术的应用 　　荧光抗体技术在临床上可用作肿瘤细胞的诊断；细菌、病毒和寄生虫的检验及自身免疫病的协助诊断等方面。 一、荧光显微镜技术的应用 二、荧光免疫测定的应用 思考题 1．荧光、荧光效率、荧光寿命和荧光淬灭的概念是什么？ 2．常用的荧光物质有哪些？ 3．荧光免疫技术有哪些类型？ 4．荧光抗体技术的基本原理是什么？ 3．什么是荧光抗体？如何制备、纯化和鉴定荧光抗体？ 4．荧光抗体染色有哪些方法？各自的反应原理是什么？ 5．荧光免疫测定的基本原理是什么？有哪些方法类型? 课堂练习 1、用于标记荧光抗体的荧光素应符合下列要求，除外 A 与蛋白质分子形成离子键 B 荧光效率高，与蛋白结合后仍能保持较高的荧光效率 C 荧光色泽与背景组织色泽对比鲜明 D 与蛋白质结合后不影响蛋白质原有的生化和免疫学性质 E 标记方法简单，安全无毒 （A） 2、荧光显微镜的结构中，与普通光学显微镜相同的是 A 光源 B 滤板 C 聚光器 D 目镜 E 物镜 （D） 3、不能作为荧光显微镜光源的是 A 高压汞灯 B 氚灯 C 紫外灯 D 氙灯 E 卤素灯 （C） 4、荧光抗体染色技术中，特异性最高，非特异性染色最低的方法是 A 直接法 B 间接法 C 补体结合法 D 双标记法 E 以上都不对 (A) 5、目前公认的最有效的检测抗核抗体的方法是 A ELISA B 放射免疫技术 C 直接凝集实验 D 直接荧光法 E 间接荧光法 (E) 6、FITC在紫外光的激发下，所产生的荧光为 A 灰蓝色 B 黄绿色 C 橙色 D 暗红色 E 橙红色 （B） 7、双标记荧光抗体技术的主要用途是 A 提高荧光强度 B 提高荧光效率 C 可同时检测同一标本中两种抗原 D 使用一种标记物可检测多种抗原 E 减少非特异性荧光 （C） 8、时间分辨荧光免疫测定特点中不包括 A 标记物荧光衰变时间长 B 测定范围狭窄 C 标记物为镧系元素 D 能排除非特异性荧光的干扰 E 荧光强，灵敏度高 （B） 9、下列有关时间分辨荧光免疫测定的叙述中，错误的是 A 以镧系螯合物作为标记物 B 镧系螯合物具有超短荧光寿命的特点 C 可以有效的消除非特异性自然本底荧光的干扰 D 增强液的主要成分是B-二酮苯 E 灵敏度较普通荧光抗体技术高 （B） 10、时间分辨荧光免疫测定所用的荧光标记物为 A FITC B RB200 C TRITC D 镧系元素螯合物 E 4-甲基伞型酮 （D） * * * * * （1）异硫氰酸荧光素（FITC）　其荧光为黄绿色 （2）四乙基罗丹明（RB200）　其荧光为橘红色 （3）藻红蛋白（PE） * * * 磷酸盐缓冲液PBS 检验学院 何 涛 教学目的要求： 掌握免疫荧光显微镜技术 掌握时间分辨荧光免疫技术 了解荧光免疫测定的临床应用 1、概述　　荧光免疫技术是将抗原抗体反应的特异性与荧光技术的敏感性结合起来的一种方法，是免疫标记技术中发展最早的一种检测方法。 近年来，随着科学技术的发展，一系列新的仪器和技术问世，使荧光技术不断完善，已从原来仅限于检测固定标本，如检测组织切片或细胞表面的抗原，扩大到进行活细胞分类检测及多种成分定量检测。荧光技术已被广泛应用于临床检测和科学研究。 2、技术分类： ⑴荧光抗体技术(荧光显微镜技术) 抗原抗体反应后，利用荧光显微镜判 定结果的检测方法。 ⑵ 免疫荧光测定技术： 抗原抗体反应后，利用特殊仪器测定 荧光强度而推算被测物浓度的检测方法 第一节　荧光免疫技术的特点