菌株分离鉴定、药敏实验及PCR扩增实验过程.docVIP

目录 2.1菌株的分离纯化 1 2.1.1菌株的分离 1 2.1.2菌株的纯化 1 2.2菌株的鉴定 2 2.2.1革兰氏染色镜检 2 2.2.2菌株的生化鉴定 2 2.3药敏试验 3 2.3.1药物的配制 3 2.3.2质控 4 2.3.3MIC（最小抑菌浓度）实验 4 2.4 CTX- M型基因的PCR扩增模板的提取 7 2.5 CTX- M型基因的PCR扩增 7 2.5.1 PCR 扩增引物及条件 7 2.5.2电泳检测PCR扩增产物 8 2.1菌株的分离纯化 2.1.1菌株的分离 2.1.1.1实验的准备 1.分离管的准备：本实验需要100个50ml离心管 （1）用过的离心管，将盖子拧开，加入清洁剂，沸水浴10min，毛刷清洁； （2）没入加入清洁剂的水中，灌满水，不要留有大气泡； （3）放入超声清洁机中超声清洁45min，25℃,100Hz； （4）倒出管中水，灌满去离子水，再超声20min，25℃，100 Hz； （5）倒出管中水，重复（4）一次； （6）倒出管中水，放入60℃烘箱中烘干； （7）待烘干后装入保鲜袋中，扎孔通气，再用报纸或牛皮纸包好，放入高压锅中高压灭菌，121℃，20min； （8）高压后取出放入烘箱中，烘干后待用。 2.BPW（蛋白胨水）的配制：按所选试剂的规格进行配制，再送入高压锅中高压灭菌，高压后放入烘箱中烘干待用。注意瓶装液体高压前一定要盖子拧松。 3.试管的准备：本实验需要100根试管 （1）塞子拔出，与试管一起放入清洁剂水中，沸水浴煮沸10min，毛刷清洁； （2）10个一捆，于烘箱中烘干后，塞上塞子，报纸或牛皮纸包好，高压； （3）取出后烘干待用。 4.LB肉汤培养液的准备：本实验需要100根LB管 根据所选购商品说明配制，将配制好的LB培养液，分装到100根干净试管，每根3ml，包好后于121℃高压15min，烘干待用。 5.麦康凯琼脂培养基的准备： 按所选商品说明配制，121℃高压15min，温度稍凉后于超净台中倒板，待吹干后收板待用。 2.1.1.2实验过程 （1）每个分离管装入20mlBPW； （2）三点取样剪取100份待检肉样分装到100个分离管中，按肉样的标号在分离管上标号，放入37±1℃温箱摇床上培养6h，200r； （3）取分离管中的菌液50μL加入LB管中，标号，37±1℃温箱摇床上培养10-12h，200r； （4）用接种环取一环菌液画到麦康凯琼脂培养基上，标号，37±1℃温箱过夜培养。 2.1.2菌株的纯化 2.1.2.1实验的准备 1.伊红美兰（EMB）琼脂培养基的准备： 按所选商品的规格配制，121℃高压15min，温度稍凉后于超净台中倒板，待吹干后收板待用。 2. LB肉汤培养液的准备：同2.5.1.1.1中LB肉汤培养液的准备。 2.1.2.2实验过程 （1）接菌：用2.5μL或10μL移液枪的枪头挑取麦康凯琼脂培养基上的单菌落，将枪头打到LB管中，标号，37±1℃温箱摇床上培养10-12h，200r； （2）划板：用接种环取一环菌液画到麦康凯琼脂培养基上，标号，37±1℃温箱过夜培养； （3）用接种环挑取麦康凯琼脂培养基上的单菌落划到EMB板上，标号，37±1℃温箱培养18-20h； 2.2菌株的鉴定 2.2.1革兰氏染色镜检 在麦康凯琼脂上长出红色的菌落，在伊红美兰琼脂上长出黑色、带金属光泽的菌落。挑取典型菌接种于MH肉汤培养基，37± 1 ℃培养12-24 h，取出1接种环菌液进行固定、革兰氏染色和镜检，根据细菌形态和染色特点，将革兰氏染色为阴性、两端钝圆、无芽胞、中等大小的杆菌初步判定为大肠杆菌。 2.2.2菌株的生化鉴定 1.实验准备 生理盐水、液体石蜡高压进行灭菌，待用。 提前复活菌株，吸取30-50μL甘油保存菌液于LB肉汤，摇床培养3-5h（时间因菌株活性不同做适当调整，此步主要是保证菌株全部复活）。 纯化菌株：将LB肉汤复活的菌株接种到麦康凯板，37℃过夜培养，18-24h。要求所有受试菌株必须是单一的菌落形态而且有单个菌落存在。 2.实验过程 （1）接种前准备 安瓿瓶：从包装盒中取出安瓿瓶，朝易折点(瓶颈上蓝点)反方向用力折开安瓿瓶，或用砂轮划一圈安瓿瓶瓶颈处，然后用力掰开安瓿瓶，插入安瓿瓶架或双面板中。 试管：从包装盒中取出试管，插入试管架中。 注：如果染菌或变色，则不能使用，重新拿一支。折开安瓿瓶时最好包裹纱布，以免划伤手指。 （2）接种方法 直接接种：用接种针从平板上挑取已纯化分离的菌落接种于需要试验的安瓿瓶（试管）中。 菌悬液法：取一内盛有2ml无菌水试管，用接种针从平板上挑取已纯化单个菌落至无菌水中仔细研磨制成0.5麦氏浊度的均一细菌悬液，滴入需要试验的试管（安瓿