流式中参数的意义.docVIP

流式中参数的意义前向角散射，即FSC与细胞直径平方正相关（大小），所以我们平时上机的时候，有时用FSC做阈值，排除碎片及其它颗粒，避免干扰。侧向角散射，即SSC是指与激光束正交90度方向的散射信号，它对细胞膜、胞质、核膜的折射率更敏感，可以提供细胞内结构及颗粒性质的信息FL2-A ，FL2-W 中A和W的含义FL2-H1024，FL2-H256 中H的含义，1024和256又代表什么呢。名词“道数”是怎么定义的？w好像代表脉冲宽度，但是脉冲宽度反映的是细胞什么特性呢？H-脉冲高度反映细胞什么特性呢？好像你做的是细胞周期分析，如果是，FL2－A代表的是荧光峰面积，反映了细胞DNA含量（前提是用Rnase处理去掉了RNA）；FL2－W代表的是荧光峰宽度，这个值可以区分单个细胞和双联体细胞；下面的1024和256是定义数据文件大小的（记得培训时工程师这么说的）－H好像没有什么特殊含义 ，就是指这个通道了，一般检测那个通道的荧光就是选择哪个－H，比如FSC－H，SSC－H，FL1－H等等流式涉及的调节参数太多了，主要的有：1.电压2.阈值3.荧光补偿4.通道选择：需要哪些通道、选择面积/高度/宽度、线性/Log5.停止条件选择太多太多了 FL2-A代表FL2 AREA，FL2-H即FL2 HEIGHT，通过这两个参数，可以将粘连体排除出去，因为粘连体跟多倍体有相同的FL2-A，但是FL2-H远远大于正常细胞。正确的设置是将FL2-A设置在200附近。当然，不设在200也可以，但是那样会对日后的分析造成困难。200道是对周期分析最佳的参数。 FSC是前向角散射，一般代表细胞的体积，值越大代表细胞越大。SSC是侧向角散射，一般代表细胞的颗粒度，值越大代表细胞的颗粒度越大，颗粒度指细胞表面的皱折度，细胞内亚细胞器、颗粒的数目等。 我初接触流式，很多东西都不是很清楚，查了园子里的资料也是一知半解的：1.流式中FL1，FL2，FL3，FL4分别是指的什么？2.PI单染观察细胞周期可以选其中的哪些呢？为什么？3.如果FL选用不恰当，对结果会有影响吗？表现在那些方面呢？我回答第一和第三个问题：一，FL1，FL2，FL3，FL4指的是第1，第2，第3，第4个荧光，FL是 fluorescence荧光的意思三，对于流式检测最初的一步就是选择何种方法，通常是何种荧光物 质标记的抗体。厂家根据需要开发了各种荧光标记的抗体，进行选择时首先要满足的就是所选择的抗体必须在流式上能够检测,各单位买的流式仪功能不完全一致，首先要和检测方进行联系，看能否检测。在附表里我将常用的荧光标记物质的激发波长和检 测波长给出，可以参考。有几个原则一起说一下： 1 流式检测时首推荧光物质直接标记的抗体，如果没有直接标记的抗体，用间接法，即二抗上标记荧光分子同样可以。不过这增加了处理的难度，处理步骤增多，往往会不同程度影响检测结果 2 厂家推出的抗体有一些明确写明适合流式检测，而另一些则表明适合免疫组化、western等，首选前者，可以保质保量，但是后 者并不是不可以用，一般来说如果没有明确的表明适合流式检测 的抗体，采用后者也是可以的，不过要注意其检测结果不一定非常理想。 3 单抗和多抗均可应用。 4 绿色荧光蛋白等本身有荧光的物质在检测时会占据一个荧光通道，我也曾碰到几次有人将转了绿色荧光蛋白的细胞再采用FITC 标记的抗体来检测目的蛋白（据说还有人用此方法得出了满意的 结果！），岂不知绿色荧光蛋白和FITC是一个荧光通道，更本不 能一起检测。 5 如果是检测淋巴细胞这类细胞，经常用到多种抗体同时标记，选择时切勿选错。我自己比较倾向于多重标记，因为这样可以减少抗体和细胞用量，特别是对于小鼠的血标本，经常采到的血量微少，采用多重标记更有利。当然这要求流式操作者有较高的水平，注意调节流式仪的各种参数。Annexin V/PI双染色法基本原理细胞凋亡早期改变发生在细胞膜表面，目前早期识别仍有困难。这些细胞膜表面的改变之一是磷脂酰丝氨酸（PS）从细胞膜内转移到细胞膜外，使PS暴露在细胞膜外表面。PS是一种带负电荷的磷脂，正常主要存在于细胞膜的内面，在细胞发生凋亡时细胞膜上的这种磷脂分布的不对称性被破坏而使PS暴露在细胞膜外。Annexin V是一种Ca+依赖的磷脂结合蛋白，最初发现是一种具有很强的抗凝血特性的血管蛋白，Annexin V具有易于结合到磷脂类如PS的特性。对PS有高度的亲和性。因此，该蛋白可充当一敏感的探针检测暴露在细胞膜表面的PS。PS转移到细胞膜外不是凋亡所独特的，也可发生在细胞坏死中。两种细胞死亡方式间的差别是在凋亡的初始阶段细胞膜是完好的，而细胞坏死在其早期阶段细胞膜的完整性就破坏了。因此，可以建立一种用Annexin V结合在细胞膜表面作为凋亡的指示并结合一种染