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DNA的粗提取与鉴定 第一节 探索遗传物质的过程 实验用具：铁架台；铁环；镊子；三角架；酒精灯；石棉网；载玻片；玻璃棒；滤纸；滴管；量筒（100ml，一个）；烧杯；（100ml，一个，50ml、500ml各二个）；试管（20ml，二个）；漏斗；试管夹；纱布。 以鸡血为实验材料进行DNA的粗提取 三、实验过程 ②鸡血细胞极易吸水胀破，而用动物肝脏细胞作实验材料常常需要匀浆和离心，对设备要求较高，操作繁琐，历时较长 1、鸡血细胞做实验材料的原因 ①鸡血细胞核的DNA含量丰富，材料易得 2、实验原理 ① DNA在NaCl溶液中的溶解度，是随着NaCl的浓度的变化而改变的。当NaCl的物质的量浓度为0.14 mol／L时,DNA的溶解度最低。利用这一原理，可以使溶解在NaCl溶液中的DNA析出。 ② DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些蛋白质可以溶于酒精溶液。利用这一原理，可以进一步提取出含杂质较少的DNA。 ③ DNA遇二苯胺（沸水浴）会染成蓝色，因此，二苯胺可以作为鉴定DNA的试剂。 4、课前准备鸡血细胞液 取质量浓度为0．1g/ml的柠檬酸纳溶液（抗凝剂）100ml，置于500ml烧杯中。注入新鲜的鸡血（约180ml），同时用玻璃棒搅拌，使血液与柠檬酸纳溶液充分混合，以免凝血。将烧杯中的血液置于冰箱内，精置一天，使血细胞自行沉淀。（也可以将血液倒入离心管内，用1000r/min（转每分）的离心机离心2min，血细胞沉淀于离心管底部。实验时。用吸管除去离心管上部的澄清液，就可以得到鸡血细胞液。） ①过程 ②柠檬酸钠作用 防止血液凝固 ③作用机理 柠檬酸钠能与血浆中的Ca2+发生反应，生成柠檬酸钙络合物，血浆中游离的Ca2+大大减少，血液就不会凝固 鸡血细胞破碎以后释放出的DNA，容易被玻璃容器吸附，所以在提取过程中为了减少DNA的损失，最好使用塑料的烧杯和试管盛放鸡血细胞液 ④注意事项 讨论：提取鸡血中的DNA时，为什么除去血液中的上清液？ 答：血液分为两部分，一部分是血浆，一部分是血细胞，离心后除去的上清液是血浆 5、方法步骤 将制备好的鸡血细胞液5 mL～10mL，注入到50 mL烧杯中。向烧杯中加入蒸馏水20 mL，同时用玻璃棒充分搅拌5 min，使血细胞加速破裂。然后，用放有纱布的漏斗将血细胞液过滤至500mL。取其滤液。 ①提取鸡血细胞的细胞核物质 小组合作讨论： 答：让细胞内浓度大于周围溶液的浓度，细胞会吸水以至胀破 （1）为什么要加入蒸馏水？加入蒸馏水后细胞会有什么变化？ （2）用玻璃棒搅拌有什么意义？ 答：用玻璃棒搅拌可以加速血细胞和细胞核的破裂。注意应沿一个方向快速搅拌，但也不能太快太猛，防止打碎DNA （3）滤去的是什么物质？得到的是什么？ 答：过滤将滤去的是细胞膜和核膜等物质；得到的是与蛋白质等物质结合在一起的DNA ②溶解细胞核内的DNA 将氯化钠的物质的量浓度为 2 mol的溶40mL加入到滤液中，并用玻璃棒沿一个方向搅拌1min，使其混合均匀，这时DNA在溶液中呈溶解状态 沿烧杯内壁缓缓加入蒸馏水，同时用玻璃棒不停地轻轻搅拌，这时烧杯中有丝状物出现，注意观察丝状物呈什么颜色。继续加入蒸馏水，溶液中出现的粘稠物会越来越多。当粘稠物不再增加时停止加入蒸馏水（这时溶液中氯化钠的物质的量浓度相当于0.14 mol／L） ③析出含DNA的粘稠物 讨论：加入蒸馏水的目的？ 降低NaCl溶液浓度到使DNA溶解度最低点，使DNA从NaCl溶液中析出 将溶液中的DNA与其他杂质分离，这一步骤是实验成败的关键。实验中应该缓慢贴壁加入蒸馏水，并轻轻地沿一个方向不停地均匀搅拌，以利于DNA分子的附着和缠绕 注意事项： ④滤取含DNA的粘稠物 用放有多层纱布的漏斗，过滤步骤3中的溶液至 500mL的烧杯中，含 DNA的粘稠物被留在纱布上 ⑤将DNA的粘稠物再溶解 取 1个 50 mL烧杯，向烧杯内注入氯化钠的物质的量浓度为 2 mol／L的溶液 20mL。用钝头镊子将纱布上的粘稠物夹至氯化钠溶液中，用玻璃择不停地搅拌，使粘稠物尽可能多地溶解于溶液中 答：因为DNA不溶于冷酒精，而其他物质可以溶解在酒精中，使含杂质较少的DNA丝状物可以析出,悬浮于溶液中 小组讨论： （2）观察丝状物呈什么颜色？ 答：白色 （1）为什么要加50mL的冷酒精？ 取两支20 mL的试管，各加入氯化钠的物质的量浓度为0．015 mol／L的溶液5 mL，将丝状物放入其中一支试管中，用玻璃棒搅拌，使丝状物溶解。然后，向两支试管中各加入4mlL的二苯胺试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热 5 min，待试管冷却后，观察并且比较两支试管中溶液颜色的变化 ⑧ DNA的鉴定 过滤时使用的纱布层数与需用滤液或黏稠物有关，第二次要用其滤出的黏稠物有关