1805微生物操作SOP(第一版)1介绍.doc

1805组 微生物、化学实验方法 学 （第一版） 编制人（按拼音排序）：曹海龙；黄李淑馨；刘航；刘启顺 王晓辉；杨凤丽；岳敏；赵勇 编制日期：2011年11月15日  目录 第一章、无菌操作技术 4 1.1 常用灭菌方法概述 4 1.1.1、加热法 4 1.1.2过滤除菌 5 1.1.3、辐射杀菌 6 1.1.4、化学药物的消毒与灭菌 6 1.2 灭菌方法 7 1.2.1 干热空气灭菌 7 1.2.2 高压蒸汽灭菌 8 1.2.3 紫外线及化学试剂灭菌 12 1.2.4 微孔滤膜过滤除菌 13 1.2.5 化学消毒剂的杀菌作用 14 1.3 无菌操作和微生物接种技术 17 第二章、菌种的保藏 24 2.1 菌种保存方法概述 24 2.2实验室常用菌种保存方法 24 2.2.1 定期移植保藏法 24 2. 2.2 -80℃低温冷冻保藏 24 2.3复苏方法 25 第三章、感受态菌株的制备及DNA转化方法 26 3.1大肠杆菌感受态菌株的制备及DNA转化方法（黄李淑馨） 26 3.1.1 大肠杆菌感受态细胞的制备（氯化钙法） 26 3.1.2大肠杆菌感受态细胞的转化 26 3.2短乳杆菌感受态菌株的制备及DNA转化方法（岳敏） 26 3.2.1 短乳杆菌感受态细胞的制备 26 3.2.2短乳杆菌感受态细胞的转化（电转化方法） 27 3.3酿酒酵母感受态菌株的制备及DNA转化方法（曹海龙） 27 3.3.1 短乳杆菌感受态细胞的制备（醋酸锂法） 27 3.3.2酿酒酵母感受态细胞的转化（醋酸锂法） 28 3.4毕赤酵母感受态菌株的制备及DNA转化方法（刘航） 28 3.4.1实验前的准备 28 3.4.2限制性酶切 28 3.4.3毕赤酵母感受态细胞的制备 28 3.4.4电转化 29 第四章 基因的克隆与测序（黄李） 30 4.1基因克隆的常规方法 30 4.2基因组文库基因克隆方法（黄李） 30 4.3RACE法基因克隆（张建平） 30 第五章 酶的表达方法 31 5.1大肠杆菌系统表达方法（黄李） 31 5.2毕赤酵母系统表达方法（刘航） 31 5.2.1毕赤酵母组成型基因表达方法 31 5.2.2毕赤酵母诱导型基因表达方法 31 第六章 酶活的测定方法 32 6.1多糖降解酶酶活测定方法 32 6.1.1壳聚糖酶酶活的测定方法（张建平） 32 6.1.2几丁质酶酶活的测定方法（赵勇） 32 6.1.3褐藻胶裂解酶酶活的测定方法（黄李） 32 6.1.4菊粉酶酶活测定对方法（曹海龙） 33 6.2代谢过程酶酶活测定方法 35 6.2.1丙酮酸羧化酶酶活测定方法（曹海龙） 35 6.2.2异柠檬酸裂解酶酶活测定方法（曹海龙） 37 第七章 酿酒酵母基因敲除方法（曹海龙） 39 第八章 酶的分离纯化方法 42 第九章 化学实验注意事项和方法学（刘启顺、杨凤丽）………………………………42  第一章、无菌操作技术 （王晓辉） 1.1 常用灭菌方法概述 微生物在自然界中分布广泛，为了保证生产和科学研究所需菌株不受其它杂菌干扰，灭菌和消毒技术至关重要。灭菌和消毒两者概念不同，灭菌是指杀死或消灭环境中所有微生物（包括芽孢和孢子）；消毒是指消灭病原菌和有害微生物营养体。但对于同一种方法来说，不同作用强度和时间可达到灭菌或消毒不同目的。 灭菌和消毒方法有多种，分为物理法和化学法两大类。物理法包括加热灭菌（干热灭菌和湿热灭菌）、过滤除菌、紫外线灭菌等。化学法是利用无机或有机化学药剂进行消毒与杀菌。人们可根据微生物特点、待灭菌材料、实验目的和要求选用不同灭菌和消毒方法。 、加热法 加热灭菌主要利用高温使菌体蛋白质变性或凝固、酶失活而达到杀菌目的。根据加热方式不同，分为干热灭菌和湿热灭菌。 （一）干热灭菌 干热灭菌包括火焰烧灼灭菌和热空气灭菌。火焰烧灼灭菌适用于接种环、接种针、接种钩等。无菌操作时试管口和瓶口也在火焰上作短暂烧灼灭菌。对于小刀、镊子、载玻片、玻璃涂棒可预先浸泡在75%酒精中，使用时取出，瞬间通过火焰灼烧灭菌。 应该注意的是，接种完毕，接种针灼烧先从中部开始（使热度由针的中部传递到端部，使微生物逐渐焦化），再将针端移到火焰上直立灼烧；也可将接种针置于外焰过渡处理后再彻底灼烧，避免直接灼烧微生物引起爆散污染环境。 热空气灭菌是利用加热的高温（160℃～180℃）空气进行灭菌的方法。此法适用于耐高温玻璃制品、金属制品及保藏微生物用的沙土石蜡油碳酸钙等物品的灭菌，同时对新制作的试管及三角瓶棉塞具有固定形状作用。 （二）湿热灭菌 湿热灭菌主要通过加热煮沸或热蒸汽杀死微生