8.DNAFeulgen染色课件.pptVIP

* DNA的Feulgen染色法 1.了解Feulgen染色反应原理； 2. 掌握Feulgen染色的方法，观察染色结果。 实验目的 DNA经弱酸（lmol／L HCI）水解,其上的嘌呤碱和脱氧核糖之间的配糖键打开,使脱氧核糖的一端形成游离的醛基,这些醛基在原位与Schiff试剂(无色品红亚硫酸溶液)反应,形成紫红色的化合物,使细胞内含DNA的部位呈紫红色阳性反应. 实验原理 碱性品红为红色，结构如图1中A，A与能产生SO2的试剂作用后（如偏重亚硫酸钾与盐酸作用，还原出SO2），双链打开，成为无色的Schiff试剂，Schiff试剂的结构如图中B所示，B分子再与2个醛基（DNA水解后释放出的醛基）结合又出现双链，成为结构如图中C所示的化合物，呈紫红色。 图1 Feulgen反应的染色原理 DNA染色后，除形成紫红色C化合物外，必然有多余的A和B分子，B分子很容易被氧化转变为A有色分子，从而造成伪差。因此必须迅速地多次用现配的SO2水清洗，使A分子转变为无色的B分子，消除染色的伪差。 本次实验对照组的设立：①不经稀酸水解；②预先用热三氯醋酸或DNA酶处理，抽提去细胞中的DNA，而得到阴性反应，从而证明了Feulgen反应的专一性。 实验用品 材料 洋葱内表皮 试剂 Carnoy固定液 l mol/L HCl Schiff试剂 亚硫酸水溶液(漂白液) 0.5%固绿染液 实验方法： 取材（洋葱内表皮） ↓ 固定 10—15分钟 ↓ 对照2 ┌──水洗 2分钟 →5%三氯醋酸90度15分钟 对│ ↓ ↓ 照│ 水解(1M HCl ) （置室温1分钟后，60℃8分钟） 1 │ ↓ │ 水洗（可省） │ ↓ └─→反应 ( Schiff s) （暗袋中 40分钟） ↓ 洗涤 ( 亚硫酸水) 洗三次，每次5分钟 ↓ 水洗 5分钟 ↓ 复染（0.5 ％固绿) 1分钟 ↓ 水洗 ↓ 镜检 实验组：细胞核呈紫红色，核仁及细胞质呈绿色 1.取材薄，幼嫩，大小合适。 2.固定剂以Carnoy固定最合适，涂片可用甲醇固定。 3.水解时间勿过短或过长。 4.Schiff试剂质量可靠，无色，强刺激气味，密封， 避光使用保存（6个月）。 5.洗涤剂现用现配，保持有足够的二氧化硫浓度。 6.认真做对照，以示阳性反应的真实性。 7.对照组不可反应40分钟以上。 8.避免固绿过染。 注意事项 思考题 结合实验原理分析实验中的注意事项及实验成败的因素。