N端和C端结构域对于P2X的组装是非必要的题稿.docx

N端和C端结构域在P2X内的组装是分散的单克隆抗体免疫共沉淀（抗FLAG,抗HA）的非离子洗涤剂过去也被用作为探针，通过考察P2X2缺失突变体和嵌合能力与在HEK293细胞全长P2X2和P2X3亚基的关联来探查在HEK293细胞中P2X2受体装配[100]。免疫共沉淀显示无论是胞内功能区的N端还是C端结构域（直到28rP2X2残基和362rP2X2远端残基，分别对应30zfP2X4和370zfP2X4）都不是全长rP2X2 或 rP2X3 亚基细胞表面表达和组装所必需的。此外，通过α7nAChR信号肽裂解置换 rP2X2残基 1-50 （包括整个TM1螺旋）并没有阻止全长rP2X2 或 rP2X3 亚基的免疫共沉淀，这些数据在很大程度上排除了胞质内N端或C端结构域或TM1螺旋在亚基识别方面的序列特异性作用。[100]BN直接显示了胞内C端结构域的三聚体的分散性，表明了hP2X5结构可以控制exon-10 residues (hP2X5+exon10)的插入，但是缺乏整个细胞内C端结构域（residues R365hP2X5+exon10 onwards）也可以和同源三聚体一样高效率的组装。[101]这三种基本残基覆盖在突变体胞内C端结构域的最末端。363KKR365hP2X5+exon10（对应着365KKR367zfP2X4)最有可能作为符合“正电荷居内规则”的拓扑基因的信号[102]。由截去ΔzfP2X4结构(residues 27-381zfP2X4对应 25-379hP2X5+exon10) 的N端和C端结构域组成的同源三聚体晶体结构证实了N端结构域和至少一部分C端结构域的组装是有分散性的。TM2通过限制胞外结构域的折叠空间影响组装通过观察截去了R304rP2X2（对应着R312zfP2X4 or R310rP2X5见图5A5A）并且删除了pre-TM2区（相当于β strand 14 of the zfP2X4结构）可以推断出TM2螺旋在同源和杂合三聚体中扮演着重要角色，并且TM2螺旋阻止了全长P2X2或P2X3亚基的组装以及自我的组装[100]。这种观点是通过两嵌合体组成的胞外段两侧的包括rp2x3跨膜螺旋（x3-x1-x3），反之亦然（x1-x3-x1）的P2X1 N-和C-末端结构域的免疫共沉淀实验进一步支持[100]。在HEK293细胞中，理由是WT P2X6可以装配rp2x1但不与rp2x3共表达[103]。有趣的是，x1-x3-x1嵌合体可以与WT rp2x6亚基共沉淀，而x3-x1-x3和WT P2X3不行[100,103]。这一发现被解释为支持一个观点，TM螺旋怀有对P2X亚基组装很关键的特异识别基序。为了研究在P2X亚基组装中TM2螺旋的作用，我们利用WT P2X5亚基发生在人类仅仅作为一种缺乏pre-tm2区和大部分的TM2螺旋由于剪接10外显子跳跃自然缺失突变体的事实（图5A5A）指定为hP2X5Δ328-349，而hp2x5Δ328-349不作为一个功能性的ATP门控离子通道表达。WT rp2x5 cDNA，其中包括exon-10密码子，导致典型的P2X受体介导的电流表达[104]。通过BN，我们可以证明，全长rp2x5亚基高效的组装为三聚体，而exon-10-lacking hp2x5只形成高阶的聚集体，完全保留在内质网[101]。尽管这些研究结果证实，TM2螺旋对P2X亚基的高效组装是绝对必须的，但是认为TM2螺旋能够提供特定亚基识别信息[ 100 ]原来是站不住脚的，至少对于P2X5亚基来说。结果的发生是因为由于广泛的丙氨酸和亮氨酸的块替换使TM2螺旋通道功能受损，但是分别通过限制性蛋白水解与BN显示扰乱折叠或者三聚体均不能做为探针。在exon-10-lacking hp2x5亚基的情况下（hp2x5Δ328-349）丙氨酸拉伸的足够长，排除了疏水性不匹配，而是被迫通过剪接跳过一半的TM2螺旋激活组装的同源三聚体和跨膜段的形成[101]。总之，这些发现与全长TM2螺旋对同源三聚体的作用是作为二膜锚的支架的观点完全契合[101]。通过C端结构域的末端与细胞膜的链接，TM1和TM2之间形成了一环状结构，限制了胞外结构的空间移动，并且因此限制了折叠空间。这种结构可以通过识别细胞表面帮助正确定位以及允许更高效的碰撞发生，从而防止相邻型之间的聚集来协助组装。所有第二跨膜结构域的形成的序列操作，包括包括在hp2x5外显子10缺失（图?5a5a）也会造成严重的亚基聚合。关于同源亚基与亚基之间相互作用的特定信息必须位于胞外段[101]的研究的结论通过zfp2x4晶体结构被支持。表明亚基间的联系主要由胞外区提供[1,2]。三种TM1螺旋在三种TM2螺旋的外面，这种结构形成了线性排列的中心离子通道[2]。在