DNA指纹图谱技术教案.pptVIP

利用rRNA 基因序列研究微生物多样性可采用不同的策略，目前一般常用以下几种方法： 二、以DNA指纹图谱技术为基础的微生物多样性研究方法 1、变性梯度凝胶电泳和温度梯度凝胶电泳 2、单链构象多态性 3、限制性片段长度多态性 4、末端限制性片段长度多态性 5、随机引物扩增多态性 6、扩增rDNA限制性酶切片段分析 。。。 。。。 变性梯度凝胶电泳（DGGE）和温度梯度凝胶电泳（TGGE） 二、以DNA指纹图谱技术为基础的微生物多样性研究方法 原理 在聚丙烯酰胺中加入甲酰胺，从正极到负极梯度递加，或是形成温度梯度，电泳中的DNA到达它的变性甲酰胺浓度或温度时，双链部分解开，造成泳动速度发生变化，从而达到分离效果。 1、变性梯度凝胶电泳（DGGE）和温度梯度凝胶电泳（TGGE） 二、以DNA指纹图谱技术为基础的微生物多样性研究方法 步骤 （1）样品总DNA提取； （2）样品16S或18SrDNA片段的PCR扩增及纯化；（3）制取变性梯度聚丙烯酰胺凝胶； （4）染色； （5）样品的DGGE分析； （6）割胶测序。 DGGE 2、单链构象多态性（SSCP） 二、以DNA指纹图谱技术为基础的微生物多样性研究方法 不同碱基序列的单链 DNA 分子构象不同，DNA片段变性成单链后受到凝胶分子筛不同作用力，最终使不同DNA片段得到分离。电泳结束后可以将不同的条带切下并测序，或采用特异性探针进行杂交，进而显示该特定微生物类群的动态变化。 3、限制性片段长度多态性（RFLP） 二、以DNA指纹图谱技术为基础的微生物多样性研究方法 根据不同生物个体或种群之间DNA片段酶切位点有所差异的特点，利用限制性内切酶进行消化，产生长短、种类、数目不同的限制性片段，然后对这些特定DNA片段的限制性内切酶产物进行分析，根据特定的限制性酶谱图可对群落中的微生物加以区分。 3、限制性片段长度多态性（RFLP） 二、以DNA指纹图谱技术为基础的微生物多样性研究方法 (1)选用rDNA的恒定区序列设计引物； (2)选择性扩增rDNA片断； (3)对扩增产物用适当的限制性内切酶进行酶切； (4)琼脂凝胶电泳分离产生限制性片断； (5)用所得到的指纹图谱进行分析，根据片段的大小以及标记片断种类和数量的不同，分析群落的结构及组成多样性。 4、末端限制性片段长度多态性（T-RFLP） 二、以DNA指纹图谱技术为基础的微生物多样性研究方法 此法与RFLP原理相同，只是在PCR引物的一端用荧光染料进行标记，这样使得限制片段长度多态性图谱更为简化，只需检测被标记的末端限制性片段，就可以分析复杂群落。 5、随机引物扩增多态性 DNA（RAPD） 二、以DNA指纹图谱技术为基础的微生物多样性研究方法 对整个基因组的DNA分子而言，某一引物可能会与单链DNA的许多位点结合，然后对扩增产物进行电泳，用溴化乙锭染色，就可以直接检验出被扩增的DNA多态性。 该技术以随机寡核苷酸作为引物，扩增得到的多态性片段较短，更方便检测两个同源或异源等位基因的有无，适用于种内和亚种更为细致的分类。 6、扩增rDNA限制性酶切片段分析（ARDRA） 二、以DNA指纹图谱技术为基础的微生物多样性研究方法 ARDRA 是用特定引物进行 rDNA的扩增，再对扩增产物进行RFLP分析，这项技术可以为土壤细菌群落水平上提供可靠的基因型特征，这项技术常被用来了解各种样品的群落结构。 ARDRA方法最大的缺点是工作量大，目前，应用该方法进行微生物群落结构分析，还没有人设置重复。 二、以DNA指纹图谱技术为基础的微生物多样性研究方法 除此以外，还有重复基因外回文序列-PCR、核糖体间隔分析、编码蛋白质的基因推测、质粒指纹图谱分析等现代分子生物学技术研究方法，不需要对微生物进行分离培养，克服了传统微生物培养技术的局限性，能够客观分析，精确解释微生物种类的多样性，给微生物生态学的研究带来了光明前景。 loading 12% 16% 18% 21% 26% 42% 52% 52% 63% 78% 96% 100% DNA指纹图谱技术在土壤微生物多样性研究中的应用 以DNA指纹图谱技术为基 础的微生物多样性研究方法 主要内容 核糖体RNA基因的介绍 核糖体RNA基因的介绍 一、核糖体RNA基因的介绍 目前在微生物分类学及菌种鉴定研究中最有用和最常用的分子是rRNA，rRNA约占细胞中RNA总量的75%~80%。 真核生物：5S、5.8S、18S、28S四种rRNA基因 原核生物： 5S、16S、23S三种rRNA基因 其中16S、18S rRNA基因大