以酵母自溶液为有机氮源培养产PHB.docVIP

以酵母自溶液为有机氮源培养产ＰＨＢ聚羟基丁酸酯(PHB)是一种由微生物合成的生物塑料，具有可生物降解特性 和生物配伍性，可广泛用于生物医学材料、环保等领域。????我国是啤酒生产大国,目前啤酒年产量已达到2000万ｔ,仅次于美国居世界第2位。生产啤酒的废弃啤酒酵母排放量约占啤酒产量的3%,即60万ｔ左右。啤酒废酵母的主要成分是活性啤酒酵母,还含有少量杂质。啤酒废酵母浑身是宝,它含有50%左右的蛋白质,6%～8%的核糖核酸(ＲＮＡ),2%的Ｂ族维生素,1%的谷胱甘肽及辅酶Ａ,还含有氨基酸等多种成分,是一类可以加以利用的巨大财富[1]。啤酒废酵母菌体自溶技术,就是借酵母菌体内的内源酶(蛋白酶、核酸酶、碳水化合物水解酶等)将菌体的高分子物质水解成小分子而溶解出菌体外的过程。在自溶物中含有原有菌体的碎片和自溶时降解出来的可溶性物质,其中包括游离氨基酸、核苷酸、肽、糖分、Ｂ族维生素、麦角甾醇及各种香味成分[2～4]。聚β 羟基丁酸酯(ＰＨＢ)是一类由微生物合成的,具有生物可降解性、生物相容性、压电性等许多独特优点的高分子功能材料,它在医药、电子、农业生产和包装材料等许多领域都具有潜在的良好应用前景。但是ＰＨＢ的高成本却限制了它的大规模生产和普遍应用。为了降低ＰＨＢ的生产成本,本课题组成功构建了同时携带透明颤菌血红蛋白基因(ｖｇｂ)、λ噬菌体裂解基因(Ｓ ＲＲｚ)和ＰＨＢ合成基因(ｐｈｂＣＡＢ)的重组大肠杆菌ＶＧ1(ｐＴＵ14),并以酵母浸粉为有机氮源,淀粉水解糖为碳源,实现了ＰＨＢ的高密度生产[5～8]。在此基础上,为进一步降低ＰＨＢ的生产成本,本研究对采用廉价的废酵母自溶液为有机氮源替代酵母浸粉的可行性进行了探索。1　材料和方法1.1　实验装置与材料ＧＳＹ 电热恒温水浴锅;500ｍＬ,1000ｍＬ锥形瓶;ＪＪ 1精密定时电动搅拌器;100温度计。酵母泥(啤酒废酵母);安琪牌鲜酒酵母;ＮａＣｌ;甲苯;乙酸乙酯;去离子水;ＮａＯＨ溶液和Ｈ2ＳＯ4溶液(调ｐＨ用)。实验菌株为重组Ｅ ｃｏｌｉＶＧ1(ｐＴＵ14)。1.2　实验方法???? 水浴锅预热至55;准确称量酵母(除特别指出外,均为300ｇ),放入烧杯,按比例加入水、ＮａＣｌ、甲苯等自溶促进剂;放入水浴,用塑料薄膜封口,搅拌,至自溶液温度稳定,用ＮａＯＨ调ｐＨ到指定值,开始计时;每隔一定时间,取少量自溶液离心(5000ｒ/ｍｉｎ,10ｍｉｎ),测上清液中氨基氮浓度,作出氨基氮浓度时变曲线;至氨基氮含量基本不再上升时停止反应,离心分离,上清液放入清洁储罐,调ｐＨ至偏酸(5.0左右),105、15ｍｉｎ消化自溶酶,冷却后抽滤;测定滤液中的氨基氮浓度,计算加液量,配制ＶＧ1(ｐＴＵ14)的培养基。1.3　分析方法??? 氨基氮分析采用甲醛滴定法;??? 细胞生长情况测定,采用分光光度法;??? 菌浓测定,采用干重法;??? ＰＨＢ的显微观察采用结晶紫染色法;??? ＰＨＢ含量测定,采用浓硫酸降解法[5]。2　结果与讨论2.1　自溶条件优化???? 为方便实验的进行,本研究首先采用安琪牌鲜酒酵母进行酵母自溶规律与自溶液应用可行性研究。最后再用废啤酒酵母验证。准确称取酵母的湿重,在60℃烘箱中干燥至衡重,称干重,计算干物质的含量。5次测量的平均结果表明,鲜酒酵母的干物质含量为34.1%,平均水分含量为65.9%。废酵母则略有不同,干物质含量仅为22.0%,平均水分含量为78.0%。在酵母自溶过程中,自溶温度是一个很重要的参数。温度太低不利于蛋白酶发挥作用,而且自溶过程中容易腐败变质。温度过高,酶失活。因此一般控制在40～60[9]。在本研究中,为保证最好的自溶效果,选用了55。除温度外,自溶反应ｐＨ、加水比、质壁分离促进剂等因素对自溶反应也均具有重要影响,为此本文对其一一研究。2.1.1　自溶反应最适ｐＨ的确定??? 酵母自溶是由酵母本身所含的酶参与进行的,酵母细胞内含有多种酶,ｐＨ值影响这些酶的活性,从而影响细胞和蛋白质的降解程度,即ｐＨ的变化会影响蛋白质及氨基酸的溢出。据报道,酵母细胞自溶的最适ｐＨ一般在5～8之间[1]。在此范围内,设计5.5,7.0,8.0三个ｐＨ值,实验中加入6.67ｍｇＮａＣｌ/ｇ鲜酵母。用4ｍｏｌ/ＬＮａＯＨ和/或2ｍｏｌ/ＬＨ2ＳＯ4调ｐＨ到指定数值。每2ｈ取样1次,测其离心液氨基氮浓度,得到图1。反应后,测自溶液ｐＨ值,均下降到5.5左右。 ??? 由图1可见,自溶液起始ｐＨ在8.0时自溶效果最差,自溶液中氨基氮浓度最低。初始ｐＨ值在7.0左右时,在数小时内自溶液的ｐＨ可自然下降到7.0以下,这一方面是由于废弃酵母本身呈酸性,另一方面是由于蛋白质降解产生氨基酸,特别是酸性氨基酸所致。此时,自溶酶综合活性最强,自溶速度最快,效果最