pcr与hrm比较在小鼠基因型介绍.pptVIP

PART * 高分辨率溶解曲线和pcr在小鼠基因鉴定中的的对比 目前，在基因型鉴定方面大部分都是通过普通pcr，但是pcr需要通过跑胶、测序，耗费了大量的时间与精力。 本次试验对象是OB和DB型老鼠，OB和DB型老鼠基因序列重复结构比较多，同时又是点突变，引物设计比较困难。 在此基础我们运用了hrm技术，首先hrm技术在操作上简单易学，不需要特异性探针，成本比较低，而且hrm的根据样品中DNA序列的长度，GC含量以及碱基互补性的差异，其极高的温度均一性使分辨精度达到对单个碱基差异的区分。 综述 ob型小鼠是由于在碱基序列的第105位发生点突变由C→T,导致该位点上的氨基酸的改变由精氨酸CGA转变为终止密码子TGA。这种突变使ob基因表达产物活性丧失,所以表现为肥胖。 db小鼠是小鼠由于编码瘦素Leptin受体的糖尿病基因胞内区外显子内发生G→T点突变导致的先天肥胖性2型糖尿病型小鼠，其小鼠表现出多食、肥胖及血压升高并且受体结合力也较低。 HRM 基本原理就是利用与 DNA双链与荧光染料相结合，在温度逐渐升高的过程中DNA会发生减色效应，通过检测双链 DNA在熔解过程中所释放的染料荧光信号所形成的特征熔解曲线，从而对基因序列中的核苷酸差异进行鉴别。 实验步骤 一、db/ob小鼠DNA提取 二、进行基因型的鉴定 1、普通pcr 2、hrm技术 1、剪尾：剪1cm左右的尾巴，或者小鼠耳朵 2、处理材料： 1）动物组织应先打碎处理为细胞悬浮液，然后10,000rpm离心一分钟，倒尽上清，加200ul缓冲液GA，振荡至彻底悬浮。 2）加入20ul proteinase k溶解，混匀。56℃放置，直至组织溶解，简短离心除管壁内水珠，隔夜消化一天 一、DNA 提取 3）、加入200ul缓冲液GB，充分颠倒混匀，70℃放置10min溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁水珠。 4）、加入200ul无水乙醇，充分振荡混匀15sec，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠。 5)、将上步所得溶液和絮状沉淀都加入一个96孔吸附板CB3中，加盖新的封口膜3,600rpm离心10min，倒掉深孔板中的废液，将吸附板重新放在深孔板上。 6）、像96孔吸附板CB3中加入500ul缓冲液GD加盖新的封口膜3,600rpm离心10min，倒掉深孔板中的废液，将吸附板重新放在深孔板上。 7）、像96孔吸附板CB3中加入500ul缓冲液PW加盖新的封口膜3,600rpm离心10min，倒掉深孔板中的废液，将吸附板重新放在深孔板上。 8)、像96孔吸附板CB3中加入600ul漂洗液PW加盖新的封口膜3,600rpm离心10min，倒掉深孔板中的废液，将吸附板重新放在深孔板上。 9）、3600rpm离心10min，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除。 10）、将96孔吸附板CB3转入一个新的96孔深孔板中，像吸附膜的中间部位悬空滴加80ul洗脱液TB，室温放置5-10min，加盖新的封口膜3,600rpm离心10min收集DNA。 常规pcr体系 成分 添加体积（uL） 10X buffer ddH2O Mg2+ dNTPs Taq Primer Primer Template 2.5 16.25 2 0.5 0.25 1 1 1 二、鉴定 常规pcr程序 HRM体系 成分 添加体积（uL） ２X HRM Analysis premix ddH2O Primer Primer Template 5 3.4 0.3 0.3 1 PART *