SSCP技术研究进展.docVIP

PCR-SSCP技术的基本概述 摘要：在分子遗传标记中，PCR-SSCP(单链构象多态性)技术是最常用的方法之一。本文主要介绍了PCR-SSCP的基本概念，发展历程，PCR-SSCP的基本操作流程，优缺点，在科研方面的应用，研究进展，以及其在未来的应用前景。拟对进行基因分型等相关实验研究的人提供一些有价值的参考意见 80年代以来，随着分子生物学技术的发展，出现了一类重要的遗传标记—DNA分子标记[1]。基因单核苷酸多态性(SNP)是指基因组中单个核苷酸变异引起的DNA序列多态性,包括单碱基的转换、颠换、插入及缺失等形式。DNA分子标记是以个体间核苷酸序列变异为基础的遗传标记，是DNA水平遗传变异的直接反映[2]。通过对分子标记的深入研究,还将最终达到在DNA水平上直接操纵有益基因的目的。在分子遗传标记中，单链构象多态性(Single-Strand Conformation Polymorphism，SSCP)技术是最常用的方法之一。 1984年，日本学者金泽等对获得的大肠杆菌正常和突变F1-ATPase基因，酶切后进行电泳分析发现，含点突变的DNA小片段在中性聚丙烯酰胺凝胶中的单链电泳迁移率与相应正常的DNA小片段的单链电泳迁移率明显不同。相同长度的DNA片段即使一个碱基不同，经中性聚丙烯酰胺凝胶电泳时，单链迁移率也会不同[3]。人们把这种由于碱基序列的差异表现出的多态现象叫作DNA的单链构象多态性(Single-strand Conformation Polymorphism,SSCP)。这一发现为单核苷酸变异的检测开辟了新途径。1989年，日本学者Orita等将此法用于检测复杂基因组单拷贝DNA中的多态现象，他们认为SSCP可以检测任何位点的点突变，有助于对遗传变异的诊断[4]。最初的SSCP用的是基因组DNA，特异性不强,在量少时有检测不出突变位点的情况。同年Orita等用SSCP对PCR扩增产物进行了分析，PCR与SSCP的结合使得分析的灵敏度大大增加，又省去了酶切等步骤，使SSCP分析改进了一步。但由于将同位素掺入PCR扩增产物中,通过放射自显影显示结果，使该技术的推广造成了一定的困难。1992年，日本学者Hoshino等对SSCP分析法作了大胆改进,用敏感的银染法直接对电泳后的凝胶进行染色，从而增强了安全性，使得该方法简便、快捷并且无须探针和酶，被广泛使用。至此，PCR-SSCP法确立。由于该方法有以上优点，因此在生物学领域得到了广泛研究和应用[5]。 PCR-SSCP技术是PCR技术和SSCP技术的结合。该技术是一种以PCR为基础，基于DNA构象差别而进行快速、灵敏、有效检测基因点突变的方法。其基本原理是经PCR扩增的DNA片段在变性剂或低离子浓度下，经高温处理使之解链并保持在单链状态下，单链DNA迁移率除与DNA长度有关外，更主要取决于DNA单链所形成的空间构象[6]。DNA单链折叠所形成的一定空间构象，在不含变性剂的中性聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，相同长度DNA单链因其碱基序列不同，甚至单个碱基不同，导致形成的构象不同，而且单链DNA构象的变化很可能引起了迁移率的改变，每条单链处于一定的位置，靶DNA中若发生碱基缺失、插入或单个碱基置换时，就会出现泳动变位，通过显色或显影后在凝胶上就会显示出带型的差别，即多态性。由此可见，PCR-SSCP分析是一种检测DNA点突变的灵敏的分析技术[7]。 1 PCR-SSCP操作过程 1.1 PCR扩增靶DNA； 1.2 将特异的PCR产物变性，而后迅速冰浴，使之成为具有一定空间结构的单链DNA分子； 1.3 将适量的单链DNA进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳； 1.4 最后通过放射性自显影、银染或溴化乙锭显色分析结果。若发现单链DNA带迁移率与正常对照的相比发生改变，就可以判定该链构象发生改变，进而推断该DNA片段中有碱基突变[8]。 2 PCR-SSCP技术的关键 2.1引物设计 引物设计是PCR 技术中关键的一步，其主要要求是：引物长度以20～30bp为宜。上下游引物之间和同一引物之间内均不能有互补序列，且每一引物本身不存在回文序列。引物中G+C比例应达50%～60%上下游引物退火温度(一般)要保持一致。引物与扩增片段中间区域和互补率要低。引物所扩增的目的基因在基因组间最好不要有同源序列。上下游引物的设计要考虑被扩增的片段长度在SSCP 技术可分辨的范围之内，一般来说在400bp以下[9]。 2.2 PCR反应 运用不同的引物及扩增不同的目的基因其反应体系构成会有差别，特别是Mg2+浓度、退火温度对扩增的特异性影响较大。SSCP分析用凝胶浓度很重要, 一般来说凝胶浓度在8%～12%之间，DNA片段越长，凝胶浓度应越小。染色的方法有3种：可用ErB(溴乙锭)染色、银染