项目十六 免疫细胞的分离.docVIP

项目十六 　免疫细胞的分离 一、抗凝血的制备 【实验原理】 　　常用的抗凝剂如肝素能阻止凝血酶的形成；乙二胺四乙酸(EDTA)和柠檬酸能与Ca2+结合；机械脱纤维使血液中血小板和纤维蛋白凝聚；从而都能阻止血液凝固。实验室常用的抗凝方法有如下几种：肝素抗凝、EDTA抗凝、脱纤维抗凝及Alsever液抗凝等方法。 　　【试剂和器材】 　　1．试剂　肝素、EDTA-Na2、Alsever液、生理盐水等。 　　2．器材　三角烧瓶、玻璃珠、试管或离心管、采血器具。 　　【步骤和方法】 　　1．肝素抗凝法 　　将肝素用生理盐水配制成250U/ml或其它浓度的溶液，115℃灭菌10min(或112℃15min)，置-20℃可保存数月。实验中常用的肝素抗凝浓度为20~50U/ml血液，实际当肝素浓度为5~10U/ml血液时已显出良好的抗凝效果。 　　2．EDTA法 　　常用EDTA二钠盐(EDTA-Na2)，用生理盐水配制成浓度为27g/L的溶液。配制时将溶液调至pH7.2，否则EDTA-Na2不溶解。用时取0.05ml即可使1ml血液抗凝。EDTA-Na2有效抗凝浓度为1~2mg/ml血液。 　　3．脱纤维法 　　在三角烧瓶中放入一些小玻璃珠(放入数目视采血量多少而定，通常放30~40粒)，将血采入后立即轻轻顺一个方向旋转，直到血纤维凝聚为止。 　　4．Alsever液抗凝法 　　血液与Aalsever液混合比例为1:1~1:2。 　　【结果判定】 　　除玻璃珠脱纤维法有血纤维凝聚之外，抗凝血中不能有血凝块出现，否则应重新制备。 　　【注意事项】 　　1．采血所用器具、抗凝剂、操作过程均应无菌。 　　2．加入血液后应轻轻混合，直到与抗凝剂均匀混合为止。常采用旋转混合的方法混匀。 　　3．抗凝血放4℃保存。 　　【方法评价】 　　肝素制备的抗凝血不易长期保存(保存时间12h)。EDTA 法能保持血小板与白细胞的正常形态，避免聚集。脱纤维法可使少量淋巴细胞丢失，但是悬液中细胞活力好，而且血小板污染甚少。Alsever可较长时间保存血液，一般可保存2~3周。 　　【临床意义】 　　抗凝血的制备是实验室常用的基本技术之一，在免疫试验及血细胞的检测中被广泛利用，是医学检验专业学生必须掌握的基本技能之一。 　　【思考题】 　　1．实验室血液抗凝法有哪些？抗凝的原理如何？ 　　2．不同抗凝法有何特点？试设想不同试验中应如何选择抗凝方法？ 　　 二、外周血中免疫细胞的分离 (Extrication of immunocyte from peripheral blood) 　　 (一) 白细胞制备　 　 【实验原理】 　　血液中白细胞的分离方法常用自然沉降法或利用高分子聚合物加速红细胞沉降的方法来分离白细胞。因血液中红细胞的密度比其它血细胞密度大，故红细胞沉降率较快，而且高分子聚合物能使红细胞凝聚成串钱状，加速其沉降，故而从血浆层中可分离到白细胞。 　　只介绍60g/L右旋糖酐沉降法。 　　【试剂和器材】 　　1．60g/L右旋糖酐　取右旋糖酐(dextran，分子量200～400kDa)6g，加生理盐水至100ml溶解，115℃灭菌15min，备用。 　　2．其它试剂　无Ca2+、Mg2+ Hanks液。 　　3．器材　试管、吸管、吸头、离心机等。 　　【步骤和方法】 　　 取适量抗凝血加入等量60g/L右旋糖酐，轻轻混匀，直立或45°角倾斜，置室 温或37℃ 30min。取出血浆层，用无Ca2+、Mg2+ Hanks液洗涤3次，每次2000r/min 离心10min。按实验要求配成所需浓度，通常为2×106个细胞/ml。 　　【结果判定】 　　 此法分离的白细胞中含60%~70％的淋巴细胞，同时也含较多的粒细胞、单核细胞、血小板及少量的红细胞。 　　【注意事项】 　　1．加速沉降时间不能超过30min，自然沉降时间不能超过60min，否则淋巴细胞也会沉积，使收获率降低。 　　2．混杂的红细胞可用NH4Cl溶液溶解，离心去除。 　　3．吸取血浆层时，也可将红细胞层上的白细胞层收获，虽然白细胞收获率高，但是红细胞的污染率也增高。 　　【方法评价】 　　加速红细胞沉降的方法除本法之外，还有30g/L明胶生理盐水、35g/L聚乙烯吡咯烷酮(PVP，分子量25kDa)生理盐水、或10g/L甲基纤维素等分离方法。这些方法简便，细胞收获率比自然沉降法高。明胶沉降法会增加白细胞粘性，对实验有一定影响。自然沉降法所得细胞损伤最小。 　　【临床意义】 　　沉降法制备的白细胞悬液，可用于许多细胞免疫试验，但是由于悬液中含中性粒细胞、血小板