产蛋白酶的初步筛选产蛋白酶的初步筛选.doc

产蛋白酶的初步筛选 摘要：目的 从鸡粪中初步筛选产碱性蛋白酶菌株，并初步通过观察蛋白水解圈与菌落直径比值判断菌株产蛋白酶能力。 方法 　 取养鸡场的鸡粪,采用含脱脂奶粉的菌种筛选培养基和稀释涂布平板发法分离产蛋白酶的菌株。 结果 农场鸡粪中含有种类较多的产蛋白酶的菌株,菌种单一性不强。 关键词： 细菌; 筛选; 胞外蛋白酶; 蛋白酶活力。  蛋白酶是催化肽键水解的一类酶,是一种重要的酶制剂,在食品、洗涤、医药、制革等工业中用途非常广泛[ 1 ] 。到本世纪初,已经报道的微生物蛋白酶估计超过900 种, 国际市场上商品蛋白酶多达80多种,其销售金额占酶制剂总销售额的75%。由于细菌生长快、易于培养产酶活性高,使其在工业化生产中具有动物、植物无法比拟的优越性。细菌产生的胞外蛋白酶种类很多:中性蛋白酶、碱性蛋白酶和酸性蛋白酶等。其中研究比较深入的碱性蛋白酶认为是最重要的应用型酶类[ 223 ] 。目前我国研究开发的碱性蛋白酶品种单一,产酶菌株多为从土壤中分离到的枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和短小芽胞杆菌[ 426 ] 。近年来,蛋白酶的分离纯化[ 729 ] 、代谢调控[ 10211 ]及基因克隆[ 12213 ]等方面的研究报道较多,而有关细菌胞外蛋白酶菌株筛选的报道却相对较少。本实验对土壤中常温下产蛋白酶细菌的筛选方法进行了初步探讨。  材料与方法 1.1 材料 1.1.1 土样　本实验所用的土样采自郊区养鸡场的鸡粪土壤。 1.1.2 培养基：牛肉膏蛋白胨培养基200ml：牛肉膏3g，蛋白胨10g, NaCl5g, 琼脂15-20g，水1000mL, PH7.0-7.2[14] 15%的灭菌脱脂奶粉溶液 1.2 方法 1.2.1 制备土壤稀释液 分别从每一份土样中取10 g土溶于90 ml无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶中，摇匀约20min，使土样与水充分混合，使细胞分散。用一支1ml无菌吸管吸取1ml土壤悬液加盛有9ml无菌水的大试管中充分混匀，此为10-1稀释液，以此类推制成10-2，10-3，10-4，10-5，10-6几种稀释度的土壤溶液。[15] 1.2.2 倒平板 取出经高压灭菌的牛肉膏蛋白胨培养基，冷却至55-60oC时往牛肉膏蛋白胨培养基中加入20.3ml,15%的灭菌脱脂奶粉溶液，混均匀后倒9皿。 1.2.3 涂布 每人分别取2个梯度(10-5, 10-6)的稀释液各200μl,均匀涂布于牛奶平板上，37oC培养30h左右观察；用地衣芽孢杆菌作为对照菌株。 1. 2. 4 产蛋白酶菌株的观察 从恒温培养箱中取出培养皿，对牛奶平板上的产蛋白酶的菌落数和菌落的直径，蛋白水解圈直径进行记录。 结果 2.1 每个菌落的生长情况 菌株编号 菌落直径(mm) 蛋白水解圈直径（mm) 蛋白水解圈/菌落直径比值 1 4 17 4.25 2 15 19 1.27 3 14 30 2.14 4 1 6 6.00 5 4 8 2.00 6 2 4.3 2.15 7 37 51 1.38 8 4 7 1.75 9 3 6.5 2.17 10 47 55 1.17 对照 75 78 1.04 讨论 本实验探索了从鸡粪中快速初步筛选产蛋白酶菌株的方法。采用含1.5%脱脂牛奶的牛肉膏蛋白胨培养基和稀释涂布平板法共筛选产蛋白酶的细菌。结果表明,含1.5%脱脂牛奶的牛肉膏蛋白胨培养基对细菌的有较好的初步筛选作用,且方便快捷。  参考文献： [ 1 ] 　唐兵,周林峰,陈向东,等. 嗜热脂肪芽孢杆菌高温蛋白酶的产生条件及酶学性质[ J ]. 微生物学报, 1999, 40 (2) : 188-193. [ 2 ] 　Anwar A, Saleemuddin M. Alkaline Protease: A Review [ J ].Bioresource Tech, 1998, 64: 175-183. [ 3 ] 　Horikoshi K. Alkaliphiles-from an indust rial point of view [ J ].FEMSMicrobiol Rev, 1996, 8: 259-270. [ 4 ] 　陈向东, 彭珍荣, 沈萍. 碱性蛋白酶高产菌株的选育[ J ]. 武汉大学学报, 2003, 49: 761-764. [ 5 ] 　Saeki K, Hitomi J, Okuda M, et al. A Novel Species of Alkaliphilic Bacillus that Produces an Oxidatively Stable Alkaline Serine Protease[ J ]. Ex