分生物学试验-农杆菌.doc

新疆农业大学 研究生课程论文 题 目： 姓 名： 院： 业： 级： 号： 目录 I 摘 要 1 关键词 1 1 农杆菌遗传转化机制 1 1．1农杆菌遗传转化的原理 1 1．2与农杆菌转化相关的基因 2 1．3?Vir基因的诱导表达 2 1．4?T-DNA复合物的形成 2 1．5?T-DNA复合物的跨膜转运 3 2 农杆菌操作步骤 3 3 农杆菌介导基因转化效率因素 3 3．1农杆菌菌株类型 3 3．2植物基因型及外植体类型 4 3．3培养方法 4 3．4再生植株的细胞起源 4 4 农杆菌转化的特点 4 4．1农杆菌转化优点： 4 4．2农杆菌转化局限性 5 展望 5 参考文献 6 关于农杆菌介导法的植物遗传转化摘 要农杆菌介导的转基因方法是目前植物遗传转化的重要方法之一本文从农杆菌介导的基因转化机制农杆菌操作步骤影响农杆菌转化率的因素农杆菌转化的优点与做论述。 关键词农杆菌 遗传转化 植物遗传转化技术也称植物转基因技术是应用DNA 重组技术将外源基因通过生物、物理或化学等手段导入植物基因组以获得外源基因稳定遗传和表达的植物遗传改良的一门技术本世纪70年代初分子生物学研究领域取得的一系列重大进展为植物基因转化奠定了基础。1974年，人们发现根癌农杆菌在感染植物时，可将其中环状的Ti质粒上的一段DNA插入植物基因组中，引起植物遗传特性的变化。以下对农杆菌介导遗传转化的机理、方法、应用范围及其影响因素等方面做一简要评述。1　农杆菌遗传转化机制1．1　农杆菌遗传转化的原理 农杆菌是一种革兰氏阴性土壤杆菌， 1907 年人们发现它是植物致瘤的起因， 它在自然条件下趋化性地感染大多数双子叶植物的受伤部位。植物细胞被侵染后， 形成肿瘤， 能够诱发冠瘿瘤的称为根癌农杆菌， 诱导毛发状根的称为发根农杆菌。用于植物遗传转化的农杆菌主要是根癌农杆菌( Agrobacterium tumefaciens) 。在农杆菌中存在一种与肿瘤诱导有 关的质 粒 ， 称 为 Ti 质 粒 ( Tumorinducing plasmid) 。农杆菌能够把 Ti 质粒上的一段DNA 转移至植物细胞， 并整合进植物基因组得以表达， 其中可转移的 DNA 片段称为 T-DNA。T-DNA的转移与边界序列有关， 而与 T-DNA 区段的其它基因或序列无关， 因此可以将 T-DNA 区段上的致瘤基因和其他无关序列去掉， 插入外源目的基因，从而实现利用 Ti 质粒作为外源基因载体的目的。这使人们受到启发， 利用根癌农杆菌 Ti 质粒这一天然的载体来构建植物基因工程载体， 将目的基因插入到经过改造的 T-DNA 区， 借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合， 并利用植物细胞的全能性， 经过细胞或组织培养， 由一个转化细胞再生成完整的转基因植株。整合进植物基因组的 T-DNA 片段能够通过减数分裂传递给后代从而得到稳定遗传的具有某种功能的转基因株系[1]。 12　与农杆菌转化相关的基因 与转化相关的基因主要包括农杆菌染色体上的基因和Ti质粒上T-DNA以外Vir区的基因。染色体基因包括chvA、chvB、att、pscA、chvD以及chvB。它们大多编码一些膜相关蛋白负责细菌向植物受伤细胞趋化移动和帮助细菌附着于植物受伤细胞上。ChvD蛋白可能在低pH和磷酸饥饿情况下提高VirG蛋白的合成水平。ChvE与VirA蛋白共同对virG起激活作用。Ti质粒的vir区大小为30?kb分virA、virB、virC、virD、virE、virG、virH等7个操纵子有24个基因共同控制着T-DNA的加工和转移总称为调控子[2]。 13?　Vir基因的诱导表达?在植物受到创伤后创伤组织的细胞释放出创伤信号——酚类化合物如乙酰丁香酮（acetosyringoneAs）。当农杆菌接受到此类信号时其vir区基因可被诱导转录。另一类诱导化合物是组成植物细胞壁的一些特异单糖As和单糖可协同诱导Ti质粒上vir区基因的表达。Vir区基因的活化首先是从virA基因开始的。VirA蛋白是一种结合在膜上的化学受体蛋白可直接对植物产生的酚类化合物感应其感应部位可能位于胞质区域。VirA蛋白的胞质区域有自激酶的功能自身被磷酸化激活后使VirG蛋白活化。VirG蛋白是DNA结合活化蛋白可以以二体或多体形式结合到vir启动子的特定区域从而成为其它vir基因转录的激活因子打开VirB、virC、virD、virE、virH等几个基因。ChvE可大大增强vir基因被As诱导的效果ChvE可结合一些单糖也可直接与VirA周质区相互作用以加强As对Vir基因的诱导[2