BUB1B基因在喉鳞状细胞癌中突变、表达及甲基化的研究.docx

中国医科大学硕士学位论文BUB1B基因在喉鳞状细胞癌中突变、表达及甲基化的研究姓名：袁海明申请学位级别：硕士专业：遗传学指导教师：李福国医科大学研究生学位论文独创性声明本人申明所呈交的学位论文是我本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标，７注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得我校或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料，与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任．论文作者签名：盔连圈日期：醴ｚ：ｓ：兰ｆ中国医科大学研究生学位论文版权使用授权书本人完全了解中国医科大学有关保护知识产权的规定，即：研究生在攻读学位期间论文工作的知识产权单位属中国医科大学．本人保证毕业离校后，发表论文或使用论文工作成果时署名单位为中国医科大学，且导师为通讯作者，通讯作者单位亦署名为中国医科大学．学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。学校可以公布学位论文的全部或部分内容（保密内容除外），以采用影印、缩印或其他手段保存论文。论文作者签名：指导教师签名：日期：?中文论著摘要?ＢＵＢＩＢ基因在喉鳞状细胞癌中突变、表达及甲基化的研究目的探讨ＢＵＢＩＢ基因突变、表达及甲基化与喉鳞癌发生发展的相关性。材料和方法一、标本来源及制备４０例标本来自于中国医科大学第一附属临床医院。患者均经病理诊断为喉鳞状细胞癌，均为首发病例，术前未经放疗和化疗。术后所取标本立即储存在一７０。Ｃ冰箱中。取冻存肿瘤标本，连续５岫切片３～５片，进行ＨＥ染色。显微镜选择问质细胞含量少于１０９６的癌巢区，做好标记。然后从癌巢区取材，同时取距癌灶２ｃｍ以上正常组织作为对照。将所取样品置液氮中速冻后锤击粉碎，收集于１．５ｍｌＥｐｐｅｎｄｏｒｆ管中，用于ＤＮＡ、ＲＮＡ和蛋白质的制备。二、方法白４０例术前未经化疗和放疗的喉鳞状细胞癌患者的新鲜手术标本中，分别取配对癌组织和癌旁正常组织进行以下检测：ｌ、提取总ＲＮＡ，反转录合成ｃＤＮＡ，利用半定量ＲＴ－ＰＣＲ的方法以，－ａｃｔｉｎ为内参，癌旁正常组织为对照，分析ＢＵＢＩＢ基因在喉鳞癌组织中的ｍＲＮＡ表达水平。２、提取蛋白质，利用Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ的方法以卢－ａｃｔｉｎ蛋白为内参，癌旁正常组织为对照，分析ＢＵＢＲＩ蛋白质在喉鳞癌组织中的表达情况。３、提取ＤＮＡ，采用聚合酶链反应一单链构象多态性（ＰＣＲ－ＳＳＣＰ）结合ＤＮＡ测序的方法检测ＢＵＢＩＢ基因在喉鳞癌组织中的突变情况。４、利用甲基化敏感的限制性核酸内切酶法检测ＢＵＢＩＢ基因启动子区域在喉鳞癌组织及癌旁正常组织中的甲基化情况。结果１、癌组织ＢＵＢＩＢ基因ｍＲＮＡ表达／Ｂ—ａｃｔｉｎ表达平均密度比值（ＡＤＶ）为０．８６３±Ｏ。１７８，癌旁正常组织为１．１２４－－＋０．３８２。４０％（１６／４０）癌组织ＢＵＢＩＢ基因ｌｌｌＪｉ凇表达低于癌旁正常组织（卢２．９２，Ｐ＜Ｏ．０５），有统计学意义。２、Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ分析发现在４０例病例中１４例癌组织ＢＵＢＲＩ蛋白质表达低于癌旁正常组织，占３５％（心．３５，Ｐ＜Ｏ．０５）。１６例ｍＲＮＡ低表达的喉鳞癌组织中ｎ例ＢＵＢＲＩ蛋白质也呈现低表达（Ｚ＝１０．９９，Ｐ（ｏ．ｏｉ）。以上经分析均具有统计学意义。３、ＰＣＲ－ＳＳＣＰ结合ＤＮＡ测序的方法检测ＢＵＢＩＢ基因在喉鳞癌和邻近正常组织中的突变情况，结果未检测到基因序列的改变。４、利用甲基化敏感的限制性核酸内切酶法检测ＢＵＢＩＢ基因启动子区域的甲基化情况，结果在４０例肿瘤组织中检测到１２例伴有甲基化（ｆ＝７．Ｏｌ，Ｐ＜Ｏ．０１），有统计学意义。５、１６例ｍＲＮＡ低表达中９例伴有甲基化ｃＺ＝１４．３４，Ｐ＜Ｏ．０１），有统计学意义。６、１４例ＢＩＪＢＲＩ蛋白质低表达中６例伴有甲基化（ｆ＝９．９６，Ｐ＜Ｏ．０１），有统计学意义。上述结果表明在喉鳞癌组织中ＢＵＢＩＢ基因的突变率是很低的，启动子区甲基化与低表达相关。提示启动子区甲基化可能是引起该基因低表达的主要原因之一，在喉鳞状细胞癌的发生发展中起作用。结论研究证实ＢＵＢＩ占基因异常与喉鳞癌发生发展相关，该基因在喉鳞癌组织中的突变率是很低的，并且ｍＲＮＡ和蛋白质表达低于邻近正常组织。发现在喉鳞癌组织中该基因启动子区甲基化与该基因低表达相一致。提示启动子区甲基化可能是引起该基因低表达的主要原因。关键词喉鳞状细胞癌；ＢＵＢＩＢ基因；ＢＵＢＲｌ蛋自质；纺锤体检控点；ＤＮＡ甲基化２?英文论著摘要?Ｍｕｔａｔｉｏｎ，ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄ ＤＮＡ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎｏｆ ＢＵＢｌＢ ｇｅｎｅ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｌａｒｙｎｇｅａｌ ｓｑｕａｍｏｕｓｃ