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第13章 分子生物学研究技术简介 分子生物学理论的产生与发展有赖于其技术体系的建立与进步，有关分子生物学研究方法与手段方面的内容，在专门的书籍中都有详细的论述。出于对本书内容的系统性和完整性方面的考虑，只简要地介绍分子生物学研究中最常用的实验技术与手段，其中有些内容放在了相关的章节中(如质粒DNA的提取纯化、核酸的超速离心、凝胶电泳和分子杂交等在第2章)介绍。 13.1 DNA分子克隆的基本原理 DNA重组技术兴起于20世纪70年代初期。1972年Berg等将λ噬菌体基因和大肠杆菌乳糖操纵子插入到SV40 DNA中，首次构建了DNA重组体(recom-binant)。次年，Cohen和Boyer将细菌质粒通过体外重组后导入大肠杆菌，得到了基因的分子克隆(molecular cloning)，由此诞生了基因工程。 基因工程是对携带有遗传信息的核酸分子进行设计、重组和加工的分子工程，包括基因的重组、克隆和表达。这个术语既可用来表示对特定基因的操作，也可泛指它所涉及的相关技术体系，其核心是构建重组体DNA，因此基因工程和重组体DNA技术有时是同义词。 重组体DNA技术是指在体外将不同来源的DNA分子进行重新组合，并使它们在适当的宿主细胞中实现增殖表达的遗传操作。而基因工程技术是指在分子水平上进行操作，在细胞水平上实现表达，其过程主要包括获得目的基因片段，连入合适载体，转入受体系统，筛选重组子和表达外源基因五个步骤。 其特点是：第一，不受亲缘关系的限制，打破了物种界限，把不同种类生物的遗传物质组合在一起，人为地将高等生物的基因(如人胰岛素基因)引入细菌，使其产生人胰岛素。第二，可以定向地改变生物的遗传特性，通过有目的的取得某种基因，并将该基因引进原本没有这种基因的生物体，改变后者的遗传特性；第三、增加目的基因的剂量。 由于生物体内某些蛋白质或其他组分的含量稀少且难以纯化，使对这些物质的详尽分子结构分析极其困难或几乎不可能，更谈不上对它们的生物利用。利用分子生物学技术可以解决这一生物学上的难题。 13.2 用于基因克隆的工具酶 在基因克隆中常用的主要工具酶见图13-1。图中显示，这类酶大体分为：①将DNA切开的酶;②将四种碱基聚合的酶；③将DNA片段连接起来的酶；④DNA片段末端修饰的酶。这些酶的发现与应用使基因操作成为可能。 13.2.1 DNA限制性内切核酸酶 1970年Smith等从流感嗜血杆菌中分离出特异切割DNA的限制性内切核酸酶，简称为限制酶。1971年Danna和Nathans用此限制酶切割SV40 DNA。绘制出第一个DNA限制酶切图谱。此后数年从NNN菌中分离出了许多修饰性甲基化酶和限制性内切核酸酶。 1973年Smith和Nathans提出修饰一限制酶的命名法：取分离菌属名的第一个字母，种名的前两个字母，如有株名也取一个字母，当一个分离菌中不只一种酶时，以罗马数字表示分离出来的先后次序。修饰性甲基化酶标以M，限制酶标以R。例如，最初分离到的限制酶是第2个分离的酶，应称为R·HindII，但R通常省略不写；相应的甲基化酶则为M·HindII。又如从大肠杆菌中分离到的甲基化酶为M·EcoRI，限制酶为EcoR工(图13-2)。 限制修饰系统主要有三类：I、Ⅱ、Ⅲ型。 (1)I型限制修饰系统是第一个被发现，为多亚基双功能酶，对DNA的甲基化和切割由同一个酶完成。 其甲基化及内切酶活性紧密偶联，两类反应均需ATP和S-腺苷酰甲硫氨酸(SAM)。 (2)Ⅱ型限制修饰系统修饰和限制活性由分开的两个酶完成。 这类甲基化酶由一条多肽链组成，限制酶由两条相同的多肽链组成。其识别序列一般为4～6bp3的回文序列。 由不同微生物分离得到的限制酶，如果识别位点和切割位点相同，则称同裂酶(isoschizomers)；如仅仅是黏性末端突出的单链相同，称为同尾酶(isoeaudarners)。由同尾酶切割的限制片段彼此相连，不能再被原来的限制酶切割。表13-1显示了部分限制性内切酶的识别序列。 表13-1 限制性内切酶的识别序列(↓表示酶切位点) (3)Ⅲ型限制修饰系统为两个亚基的双功能酶，M亚基负责识别与修饰，R亚基负责切割。其修饰与切割均需ATP提供能量，切封位点在识别位点下游24～26bp处。 限制酶的生物学功能在于降解外来的DNA，自身DNA的酶切位点由于修饰酶的甲基化而受到保护。在基因工程操作中限制酶可作为切割DNA分子的手术刀，用以制作DNA限制酶谱，分离限制片段，进行DNA体外重组等，是十分有用的工具酶。 由于DNA的遗传连