大鼠肝卵圆细胞的分离培养及干细胞标志分析-第三军医大学学报.docVIP

一种改进的大鼠胎肝干细胞分离纯化方法 王亚萍，佟明华，雷香丽，孔祥平，罗显荣 （510600广州，南方医科大学：附属解放军第458医院肝病防治中心) ［摘要］　目的　改进大鼠胎肝干细胞的分离纯化方法，提高肝脏干细胞分离的纯度和活力。方法　采用剪碎酶消化法分离大鼠胎肝干细胞，差速离心结合选择性消化法进行进一步纯化，含10%优等胎牛血清的DMEM/F12培养液培养。利用免疫细胞化学方法分别检测P1和P10代肝干细胞表面标志物。结果　分离的大鼠胎肝干细胞接种培养瓶24 h后开始贴壁，5 d后细胞体积增大，呈梭形或多边形。经1~2次差异性消化传代后，细胞呈集落样生长，边缘清晰且折光率强。免疫细胞化学检测示：P1代大鼠胎肝干细胞C-Kit、甲胎蛋白(AFP)抗原、OV6、细胞角蛋白(CK)19呈阳性表达，不表达ALB。P10代肝干细胞C-Kit、CK19、OV-6及CD34呈阳性表达。 结论 大鼠胎肝干细胞分离纯化、培养扩增及鉴定方法简单易行。 [关键词]　肝干细胞；细胞分离；纯化；免疫细胞化学；鉴定 [中图法分类号] [文献标志码] B [基金项目] 国家重点基础研究发展计划（973计划）（2010CB945502） [通信作者] 佟明华，E-mail:minghuat109@163.com 孔祥平，E-mail:xiangping-kong@ 肝干细胞是一种成体多能干细胞，它具有自我更新、高度增殖及向肝细胞分化的能力[1]。HSCs的分离、培养是人工肝制备的前提条件，可以为急性肝衰竭和肝代谢性疾病提供一种新的治疗手段[2]。肝干细胞在肝脏疾病治疗中具有较大的应用前景，已经引起人们的广泛关注。但是，成年动物肝脏中肝干细胞含量非常少，肝干细胞的获得常先经药物或手术造成肝脏损伤，刺激肝干细胞增殖后，再进行分离和纯化，操作复杂且成本较高。而胎肝中肝干细胞数量相对较多，可不经过刺激，直接从肝组织中分离，操作简便且成本较低[3]。本研究选择大鼠胚胎肝脏作为细胞来源，采用机械剪碎酶消化法分离获得肝干细胞，后经简单的离心分离法以及胰蛋白酶选择性消化法，得到较纯净的大鼠胎肝干细胞。 1　材料与方法 1.1 实验动物 近交系孕15d SD大鼠（SPF级），由中山大学医学实验动物中心提供。实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。 1.2　主要试剂和仪器 DMEM-F12培养基、胎牛血清购自HyClone公司；EGF、Ⅳ胶原酶购自Peprotech公司；胰岛素、台盼蓝为Sigma公司提供；氢化可得松（Amresco）；Anti-Mouse IgG Fragment购自Cellsignal公司；DAPI（Millipore）；抗兔免疫组化检测试剂盒（DAKO）；小鼠抗大鼠OV-6单克隆抗体购自RD公司；兔抗鼠AFP、CK19、C-Kit、CD34多克隆抗体均购自北京Bioss公司。CO2培养箱（美国Thermo Scientific Forma GB0083）；倒置显微镜、荧光显微镜、普通光学显微镜均购自日本 OLYMPUS公司。 1.3　方法 1.3.1　大鼠胎肝干细胞的分离和初次纯化　 无菌取出大鼠胚胎肝脏，将胎肝组织置于培养皿中以PBS充分洗涤，用眼科剪剪碎肝组织成1 mm3组织块，以冷PBS清洗去除血细胞。滴加0.05% Ⅳ型胶原酶液，于37℃水浴中消化15 min，加入等量DMEM完全培养液终止消化，并用吸管反复吹打混合液，200目筛网过滤制成单细胞悬液。细胞悬液经55×g离心5 min。转移上清液于（富含肝脏非实质细胞）另一容器中，并将其置于冰上。用PBS重悬沉淀细胞（富含肝实质细胞）,再次以55×g离心5 min。保留上清液并弃掉最后的沉淀细胞。将2次所得上清液以220×g离心5 min，收集沉淀细胞，PBS重悬洗涤细胞2次（220×g，5 min）。弃上清，在沉淀中加入含10%胎牛血清、20ng/mL EGF、0.2mol/L谷氨酰胺，5μg/ml胰岛素(Sigma公司)，1μg/ml氢化可的松的DMEM/F12培养液，制成胎肝干细胞悬液接种于0.2%明胶处理的塑料培养瓶中[3-4]。在37℃、5%CO2孵箱中培养过夜。新分离的细胞用0.25%台盼蓝染色观察细胞活力。 1.3.2 大鼠胎肝干细胞的二次纯化 在相差显微镜下每天观察大鼠肝干细胞的贴壁、生长情况和形态变化。待细胞80%长满时,加入质量分数0.25%的胰酶消化。由于成纤维细胞较肝干细胞对胰酶更为敏感，通过控制消化时间，待大部分成纤维细胞脱落，而肝干细胞仍然贴壁时，去除消化液，终止消化，继续培养，如此反复1~2次后，基本可以将成纤维细胞去除，得到较为纯化的肝干细胞[4]。待细胞80%长满以后，1