25 生物化学实验--大肠杆菌感受态细胞的制备及重组质粒的转化.docVIP

大肠杆菌感受态细胞的制备及重组质粒的转化 【目的】 1. 掌握大肠杆菌感受态细胞的制备及转化的实验方法和技术。 2. 熟悉大肠杆菌感受态细胞的制备及转化的实验原理。 【原理】 1. 大肠杆菌感受态细胞的制备、转化原理 细菌的生物学特性由于吸收外源 DNA 发生可遗传的改变叫转化，在基因克隆技术中，转化（ transformation ）特指以质粒 DNA 或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。转染（ transfection ）是指噬菌体、病毒或以它为载体构建的重组子导入细胞的过程。未经特殊处理的宿主细胞较难进行转化，细菌处于容易吸收外源 DNA 的状态叫感受态，用理化方法诱导细胞进入感受态的操作叫致敏过程。重组 DNA 转化细菌的技术操作关键就是通过一定的方法，人工诱导细菌进入一个敏感的感受态，以便外源 DNA 进入细胞内。 本实验采用氯化钙溶液处理对数生长期的 E.coli. DH-5α 细胞 , 使 E.coli. DH-5α 细胞的通透性增加，摄取外来 DNA （本实验中的质粒 DNA 为 pUC-18 ）能力增加，其原理为当细菌处于 0 ℃ ， CaCl 2 低渗溶液中，细菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的 DNA 形成抗 DNAase 的羟基 - 钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经 42℃ 短时间热冲击处理，促进细胞吸收 DNA 复合物，在丰富培养基上生长数小