03_基因工程载体分析.ppt

2.1 大肠杆菌表达载体的基本成分 * 二、噬菌体载体 M13噬菌体产生单双链DNA的机制 1、以（+）链DNA为摸板，合成互补（－）链，该双链称复制型DNA（RFDNA）。 2、RFDNA在宿主细胞内能快速增殖，可增加到每个细胞约200个拷贝。 3、单链特异的DNA结合蛋白结合在（+）链上，从而阻断了其互补链，即（－）链的合成，这样，细胞就会不断的合成（+）链DNA 。 4、游离出来的（+）链DNA先与基因V的编码产物形成特异的DNA-蛋白质复合物，然后转移到寄主细胞膜，同时基因V的蛋白质从（+）DNA链上脱落下来，余下的M13（+）链DNA则是从其感染的寄主细胞的细胞膜溢出的过程中，被外壳蛋白包装成病毒颗粒的。 * 二、噬菌体载体 * 二、噬菌体载体 * 二、噬菌体载体 插入一段lac DNA片段，即带有?-半乳糖苷酶基因(lacZ)的调控序列及其N端头146个aa编码信息，宿主F’因子携带缺失第11-41位氨基酸的lacZ’ M13mp 载体系列 * 二、噬菌体载体 单纯以噬菌体为基础构建的载体: 装载量大， 能排斥空载体， 转染效率高, 操作较难， DNA不稳定。 单纯以质粒为基础构建的载体: 有天然的抗性选择标记， 操作容易（易于分离和转化）， 较稳定, 装载量小， 转化效率较低； * 三、噬菌体-质粒杂合载体 (一)黏粒载体 （cosmid） 也称柯斯质粒载体、粘粒。这是一类用于克隆大片段DNA的载体，它是由λ噬菌体的cos（cohesive）末端及质粒（plasmid）重组而成的载体。cosmid载体带有质粒的复制起点、克隆位点、选择性标记以及λ噬菌体用于包装的cos末端等，因此该载体在体外重组后，可利用噬菌体体外包装的特性进行体外包装，利用噬菌体感染的方式将重组DNA导入受体细胞。但它不会产生子代噬菌体，而是以质粒DNA的形式存在于细胞内。 * 三、噬菌体-质粒杂合载体 黏粒载体的基本特点 具有λ噬菌体的特性(体外包装，高效感染等)； 具有质粒载体的特性(易于克隆操作、选择及高拷贝等)； 具有较高容量（45 kb）的克隆能力； 具有与同源性序列的质粒进行重组的能力。 不能体内包装，不裂解受体细胞，在细胞内不能形成噬 菌体颗粒，因而不能形成噬菌斑 。 * 三、噬菌体-质粒杂合载体 黏粒载体的构建 * 三、噬菌体-质粒杂合载体 应用黏粒作载体进行基因克隆的一般程序 * 三、噬菌体-质粒杂合载体 黏粒载体的克隆原理及步骤 1．分离外源DNA片段35～45kb 2．外源DNA与两个粘粒相连，且cos方向相同 3．体外包装：在?的A蛋白的功能作用下切割cos位点并将其中的DNA包装到成熟的?噬菌体颗粒中去 4．感染E.coli：线状的重组DNA被注入细胞并通过cos位点的环化，而形成粘粒载体，象质粒一样复制 * 三、噬菌体-质粒杂合载体 常用黏粒载体结构图 * 三、噬菌体-质粒杂合载体 缺点： A、多个Cosmid 分子重组，降低阳性率； B、多个DNA分子同时插入，失真。 * 三、噬菌体-质粒杂合载体 (二) 噬菌粒载体 由质粒载体和单链噬菌体载体结合而成的新型的载体系列。 它具有质粒的复制起点、选择性标记、多克隆位点等，方便DNA的操作，可在细胞内稳定存在；又具有单链噬菌体的复制起点，在辅助噬菌体的存在下，可进行噬菌体的繁殖，产生单链的子代噬菌体。 * 三、噬菌体-质粒杂合载体 常用的噬菌粒载体pUC118和pUC119 1. 具有较小分子量的共价、闭合、环形的基因组DNA，可 克隆10kb的外源DNA片段，并易于进行分离与操作； 2. 编码一个ampr基因作为选择记号，便于转化子的选择； 3. 拷贝数含量高，每个寄主可高达500个； 4. 存在着一个多克隆位点区； 5.可按照IPTG组织化学显色反应试验，筛选重组子； * 三、噬菌体-质粒杂合载体 6. 插入的外源基因以融合蛋白质的形式表达； 7. 含有质粒的复制起点，克隆的外源基因可以像质粒一样按常规的方式，复制形成大量的双链DNA分子； 8. 带有一个M13噬菌体的复制起点，在有辅助噬菌体感染的寄主细胞中，可以合成出单DNA拷贝，并包装成噬菌体颗分泌到培养基中； 9. 在pUC118和pUC119这两个载体中，多克隆位点区的核苷酸序列取向是彼此相反的，于是它们当中的一个可转录克隆基因的正链DNA，另一个则可转录出负链DNA； 10. 可以