SDS-PAGE失败案列及分析..doc

SDS失败实例及症状1——涂抹痕迹（smears）涂抹痕迹——例1涂抹痕迹可能由于多种原因引起，但是最常见的原因是聚丙烯酰胺凝胶倒胶的不均匀或者上样量过大。这块胶倒胶不正确，在上部胶倒入制胶槽之前就已经发生聚合。首先倒入的胶聚合发生的太快了。与其重新倒胶，不如停止倒胶重新准备新的聚丙烯酰胺混合液，然后将新的胶倒入旧胶的上方。但是显然这种连接不是非常牢固。（我推荐重新倒胶，制胶很关键，如果你后续还要做blot，胶没有跑好浪费太多了！） 涂抹痕迹——例2这块胶每孔上样量过大。大多数的泳道还是能分清条带，但是在3、4道涂抹痕迹非常明显。这些泳道的样品主要含有一种蛋白（血红蛋白的亚基），与9、10道一样。但是，3、4道的样品低估了红细胞裂解物和红细胞胞浆组分中的蛋白含量。这些组分包含了过多的蛋白以至于样品需要稀释后才能进行蛋白含量测定。但是这名学生却忘记了这个样品已经稀释过了，因此造成了蛋白浓度的低估。（严重的失误啊！）小型胶每孔的蛋白样品的量为20-40微克，取决于所需的分辨率和混合液中包含的多肽数目。但是，如果是一个纯化样品上样，一个带包含了20-40微克蛋白，那么其结果肯定也是一团糟！ 涂抹痕迹——例3这也是一个上样量过大的例子，这名学生似乎犯了和例2中同样的错误，因此在胶上也表现出各泳道的不一致性。 涂抹痕迹——例4涂抹痕迹可能常见于用非连续胶跑膜相关蛋白这类脂质含量丰富的样品。在非连续PAGE中，样品蛋白基于两个因素而被超浓缩。首先，当样品从非限制性的积层胶移动至限制速度的分离胶时迁移速率陡然下降。其次，也是最重要的，PH变化造成蛋白样品电泳速率的改变，导致样品突然停滞。一个高约半厘米左右的样品被压缩成为一个仅为数微米厚的薄层条带，局部蛋白浓度急剧增加。胞膜相关蛋白一般于较低浓度是沉淀，因此泳道的顶部通常有一条神色的条带含有沉淀的蛋白。当电泳进行时沉淀的蛋白重新溶解然后持续进入凝胶，因此造成了一个持续性的较深的不可分辨的背景。许多膜相关蛋白的凝胶图像都显示同样的特征。上图中4、7道的蛋白样品虽然含有相同的蛋白量，但是第4道的样品中含有的膜蛋白的量超过了凝胶的分辨能力，造成了很深的涂抹痕迹。 症状2——条纹拖尾条纹拖尾——例1这个不是非常严重，有条纹拖尾的泳道（图中左边第5道）也是可以用的。条纹的出现是由于一部分膜组分中的高浓度蛋白在跑积层胶过程中析出然后在很短的时间里又回到溶液中。由于分离胶表面存在轻度的缺陷（可能是在倒积层胶之前分离胶干了一些），造成整个泳道的蛋白浓度的不一致，使得出现这种条纹拖尾症状，而不是一致的很深的背景。 条纹拖尾——例2第4道也是由于上述原因而出现条纹拖尾。电场受到了第4道非均一浓度的影响而出现了条带的缩窄。注意凝胶前端染料的缺失，是由于电泳时间过长所致。 条纹拖尾——例3这块胶就非常难看了。原因在于分离胶倒完之后没有用水或者异丙醇压胶，导致分离叫上缘非常粗燥，就像你看到的一样。当样品堆积在凹凸不平的分界线时，位于凹陷部位的蛋白由于不能适当的浓缩就析出来了。然后再跑胶过程中逐渐溶解造成了条纹拖尾症状。 症状3——条带过浅条带过浅——例1这个问题可能是由于加样孔成形不佳和/或凝胶加样不认真所致。背景较深而且不均一说明蛋白可能存在于电泳缓冲液中。最有可能原因是由于装置没有正确紧密的装配导致较多的样品溢出加样孔。溢出的样品很可能不会重新溶入形成条带，因为这些蛋白从上层缓冲液的间隔持续进入凝胶。注意在凝胶下部存在一条贯穿若干泳道的水平线，说明加样孔太浅，部分样品溢出至相邻的加样孔。这个症状在一些配制正确的凝胶中也会出现，常常是在电极连通之后的数分钟内。蛋白溢出至加样孔外而不是进入积层胶。在几分钟之内发现问题可能挽救一部分损失，但是由于PH效应导致有效的样品浓缩失败，样品损失以及蛋白污染电泳缓冲液。 条带过浅——例2由于没有其他的症状，这块胶的问题似乎仅仅就是染色出问题了。考马斯亮蓝染液如果反复利用就会被SDS污染，这些回收的染液对于蛋白的染色效率就不及新鲜配制的染液。只要样品蛋白被染液中酸化的甲醇固定于胶上，那么这个问题只需要简单的重新用新鲜配制的染液染色剂可解决。 条带过浅——例3第五道旁边用“X”标记的泳道的样品蛋白含量被低估了，或者电泳样品准备时弄错了样品浓度，或者上样体积太少——可能是加样针没有正确的吸取足够的样品。和其它的样品对比，缺乏几乎所有的主要的条带，说明这个孔的问题就是上样量过低。 条带过浅——例4这是你可能遇到的问题中比较让人沮丧的。我们可以说你是非常仔细的，把每件事都做得倾向于完美，跑胶直到溴酚蓝前沿非常平直的落在胶的最底部。你用去离子水冲洗凝胶，然后将其置于摇床震荡。在这天稍晚些时候你发现你忘了将凝胶放