基因工程大题..docVIP

基因工程重要特征： l供体基因转移至受体细胞，改造生物遗传性，创造出新性状。 2 DNA分子在受体细胞内复制，为大量纯化DNA片段提供了可能。 基因工程理论依据(特点) ①基因有共同的物质基础： 有遗传功能的特定核酸序列：DNA片段或RNA。 ②基因可切割： 存在间隔序列（重叠序列的基因也可切出）。 ③基因可转移： 可在染色体DNA或不同染色体之间跳跃，基因组也可重组。 ④多肽与基因之间存在对应关系 一种多肽对应一种基因。根据表达产物的性质可 检查基因的转移或重组。 ⑤遗传密码通用 三联密码子（少数除外）与氨基酸相对应，所有物都相同，只要具备转录翻译条件均能转译出原样的氨基酸。基因可人工合成。 ⑥基因可复制传递遗传信息 重组基因可传代，获得相对稳定的转基因生物。 ※基因工程基本操作过程 分 分离目的基因 切 限制酶切目的基因与载体 接 目的基因和载体DNA在体外连接 转 将重组DNA分子转入合适的宿主细胞,进行扩增培养 筛 选择、筛选含目的基因的克隆 表 培养、观察目的基因的表达 基因工程技术的意义 大规模生产生物分子。 设计构建新物种。 搜寻、分离和鉴定生物体尤其是人体内的遗传信息资源。 限制性核酸内切酶的命名原则 ①限制性核酸内切酶第一个字母（大写，斜体）代表该酶的宿主菌属名(genus);第二、三个字母(小写，斜体)代表宿主菌种名(species)。 ②第四个字母代表宿主菌的株或型(strain)。 ③若从一种菌株中发现了几种限制性核酸内切酶，即根据发现和分离的先后顺序用罗马字母表示。 I和III类限制修饰酶的基本特征 Ⅰ型：能识别专一的核苷酸顺序，并在识别点附近的一些核苷酸上切割DNA分子中的双链，但是切割的核苷酸顺序没有专一性，是随机的。 Ⅲ型：也有专一的识别顺序，但不是对称的回文顺序,在识别顺序旁边几个核苷酸对的固定位置上切割双链。但这几个核苷酸对不是特异性的。 Ⅱ型：能识别专一的核苷酸顺序，并在该顺序内的固定位置上切割双链。这类限制性内切酶的识别和切割的核苷酸都是专一的。 Ⅱ限制性核酸内切酶的功能 1.识别双链DNA分子中4-6对碱基的特定序列 2.大部分酶的切割位点在识别序列内部或两侧 3.识别切割序列呈典型的旋转对称型回文结构 回文结构（palindrome）：序列正读和反读是一样的，即有一个中心对称轴，从这个轴朝两个方向读序列是完全一样的。 ※ II型限制性核酸内切酶的3大特点 识别位点的特异性：每种酶都有其特定的DNA识别位点，通常是由4、5或6核苷酸组成的特定序列（靶序列）。 识别序列的对称性：靶序列通常具有双重旋转对称的结构，即双链的核苷酸顺序呈回文结构。 切割位点的规范性：双链DNA被酶切后，分布在两条链上的切割位点旋转对称（可形成粘性末端或平末端的DNA分子）。 ※星活性产生的原因： (1)高甘油含量(5％, v／v)。 ? (2)限制性内切核酸酶用量过高(100U／ugDNA)。 (3)低离子强度(25 mmol／L)。? (4)高pH(8.0以上)。 (5)含有有机溶剂，如DMSO，乙醇等。 (6)有非Mg2+的二价阳离子存在(如Mn2+，Cu2+，C02+，Zn2+等。 以上因素的影响程度因酶的不同而有所不同。例如EcoRI比PstI对甘油浓度 更敏感，而后者则对高pH值更敏感一些。 常发生星活性的内切酶有：EcoRI、HindⅢ、KpnI、PstI、SalI、HinfI等。 ※抑制星号活性的方法： 1.尽量用较少的酶进行完全消化反应。这样可以避免过度消化以及过 高的甘油浓度。 2.尽量避免有机溶剂（如制备DNA时引入的乙醇）的污染。 3.将离子浓度提高到100-150mM（若酶活性不受离子强度影响）。 4.将反应缓冲液的pH值降到7.0。 5.二价离子用Mg2+。 影响限制性核酸内切酶活性的因素 ①DNA样品的纯度 可采用以下方法，提高酶活性： 加大酶的用量，1μg DNA用10U酶 加大反应总体积 延长反应时间 ②DNA样品的甲基化程度 ③ 酶切反应的温度 ④DNA分子结构 ⑤核酸内切酶的缓冲液 Ⅱ限制性核酸内切酶操作的注意事项 ①商品化的限制性核酸内切酶均为浓缩液，每次操作时应使用新的吸头去取酶，加入酶的体积应不超过总体积的 10%，否则酶液中的甘油浓度超过5%时将会抑制酶的活性。 ②整个操作应在0℃进行，即在冰浴中进行，而且是在加入其它试剂之后，最后加入酶。 ③当切割大量DNA时，通常采用延长反应时间，减少酶的用量。 ④当DNA需2种或以上酶切时，应用通用缓冲液，若没有通用缓冲液时，只有用1种酶切完后，纯化酶切产物，再 进行下一个酶切反应。 ※连接酶的主要类型 T4 DNA连接酶 大肠杆菌D