实时荧光定量PCR讲座课件.pptVIP

实时荧光定量PCR 一、概念 二、前期问题 三、准备问题 四、反应中问题 五、反应后数据分析 六、结果问题 七、 特殊问题 八、 恐怖问题 九、注意事项 END、信息交流 概念 谁会用到 Realtime qPCR？ 基本原理是什么？ …… 谁会用到 Realtime qPCR？ 精确的DNA定量 微生物检测：病毒拷贝数 转基因检测：转基因拷贝数 相对的DNA定量（差异） 基因表达差异 基本原理 利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，最终精确地对起始模板定量分析 阈值(Xn)：荧光扩增曲线指数扩增期的荧光强度标准（PCR扩增产物量的标准） C(t)值(n)：荧光信号（扩增产物）到达阈值时所经过的扩增循环次数 常用荧光检测方法 SYBR 非特异性 TaqMan 特异性与扩增的片断配对 前期问题 荧光定量要多少钱？ 我应该选用那种荧光标记方法？ ……. 荧光定量要多少钱？ SYBR方法： ＝PCR反应体系＋SYBR染料＋管子 ＝0.5+0.02+0.6 ＝1.0~1.5元 TaqMan方法： ＝ PCR反应体系＋探针＋管子 ＝0.5+1.5+0.6 ＝～3.0元 我应该选用那种荧光标记方法？ 医疗检验 TaqMan探针法 特异 准确 科研 SYBR方法 便宜 方便 TaqMan探针法 要求严格的相对定量 准备问题 双标准曲线法还是??Ct法？ 怎么作标准品？ 荧光定量PCR的反应体系特殊吗？ 什么酶可以做？ …… 双标准曲线法还是??Ct法？ 相对定量方法 基因表达差异 目标基因，内标基因 ??Ct 只依靠Ct值 用于大通量（很多基因，如芯片结果） 计算简单 估计性的结果 要求目标基因和内标基因扩增效率都比较好 双标准曲线法还是??Ct法？ 双标准曲线法 结果精确 对扩增效率要求不高 构建目标基因与内标基因的标准品 相当于两个绝对定量 每次反应都要作标准曲线 用什么作为内标基因？ 内标基因的目的：用来均一化目标基因，即保证目标基因的比较在一条水平线上 最常用的内标基因 β-actin，GAPDH 选用的 18S 表达恒定并不被处理影响的基因 容易扩增 如何制作标准品 荧光定量标准品 主要用于绝对拷贝数定量 包含扩增片断的质粒，或者基因组DNA 步骤 用设计的引物从待检测样品中扩增产物片断 纯化后装入T-Easy载体，测序 从菌中提取并纯化质粒，用分光光度计定量（ug/ul) 如何制作标准品 以Adeasy腺病毒质粒为例： 一个质粒 MW= 36820 bp X 2 X 330 = 2.43 x 107 2.43 x 107 g 6.023 x 1023个分子 = 4.03 x 10-17 g qPCR的反应体系特殊吗？什么酶可以做？ 类似于普通PCR SYBR，抑制问题 TaqMan，探针的退火 普通的Taq酶都可以胜任 TaqMan，5’外切酶活性 反应体系的调节 Mg2+，DMSO PCR反应体系 SYBR I（25?l） 10×PCR Buffer 2.5?l dNTP mix 2?l I 20 ?l: Taq 0.25?l Premix 10 ?l Primers Final 0.2?M Primers 0.4 each SYBR I 0.25~0.5× SYBR I 0.25~0.5× 反应程序的建立 按照常规PCR方法配制反应体系，并加入SYBR染料 程序 1. 95℃5min 2. 95 ℃ 20sec 3. 58 ℃ 20sec 4. 72 ℃ 20sec 5. Read Plate 6. Goto 2 repeat 39 7. 72 ℃ 5min 8. Melting curve analysis 9. End 按照常规PCR方法配制反应体系，并加入TaqMan Probe 程序 1. 95℃ 5min 2. 95 ℃ 10sec 3. 60 ℃ 40sec 4. Read Plate 5. Goto 2 repeat 39 6. End 反应中问题 熔解曲线有什么用？ 只作一次标准曲线可以