- 1、本文档共14页,可阅读全部内容。
- 2、原创力文档(book118)网站文档一经付费(服务费),不意味着购买了该文档的版权,仅供个人/单位学习、研究之用,不得用于商业用途,未经授权,严禁复制、发行、汇编、翻译或者网络传播等,侵权必究。
- 3、本站所有内容均由合作方或网友上传,本站不对文档的完整性、权威性及其观点立场正确性做任何保证或承诺!文档内容仅供研究参考,付费前请自行鉴别。如您付费,意味着您自己接受本站规则且自行承担风险,本站不退款、不进行额外附加服务;查看《如何避免下载的几个坑》。如果您已付费下载过本站文档,您可以点击 这里二次下载。
- 4、如文档侵犯商业秘密、侵犯著作权、侵犯人身权等,请点击“版权申诉”(推荐),也可以打举报电话:400-050-0827(电话支持时间:9:00-18:30)。
- 5、该文档为VIP文档,如果想要下载,成为VIP会员后,下载免费。
- 6、成为VIP后,下载本文档将扣除1次下载权益。下载后,不支持退款、换文档。如有疑问请联系我们。
- 7、成为VIP后,您将拥有八大权益,权益包括:VIP文档下载权益、阅读免打扰、文档格式转换、高级专利检索、专属身份标志、高级客服、多端互通、版权登记。
- 8、VIP文档为合作方或网友上传,每下载1次, 网站将根据用户上传文档的质量评分、类型等,对文档贡献者给予高额补贴、流量扶持。如果你也想贡献VIP文档。上传文档
查看更多
口腔内科论文口腔上皮细胞论文口腔黏膜上皮细胞体外培养影响因素分析及改进方法.
口腔内科论文口腔上皮细胞论文:
口腔黏膜上皮细胞体外培养的影响因素分析及改进方法
[摘 要] 目的分析人口腔黏膜上皮细胞培养的影响因素,并建立稳定的细胞培养体系。方法新洁尔灭和硫酸庆大霉素联合处理口腔黏膜标本,比较不同浓度的Dispase对上皮的分离作用,酶消化法分离细胞,采用无血清培养液进行原代和传代培养。结果微生物污染得到有效控制,0.40%的Dispase的上皮分离效果优于0.25%的Dispase,细胞在短期内快速稳定增殖。结论人口腔黏膜上皮细胞的原代培养方法经改进后可简化操作,并提高成功率。
[关键词] 细胞培养;口腔黏膜;上皮细胞
人口腔黏膜上皮细胞的体外培养对于研究口腔黏膜上皮细胞的生理、病理变化,上皮癌变过程以及组织工程化黏膜的构建具有重要意义。多年来,国内外许多学者一直致力于获得更为完善有效的口腔黏膜上皮细胞的培养体系。但是微生物的污染、人类黏膜组织来源的限制、上皮细胞不能贴壁以及所需营养成分复杂等仍然是上皮细胞培养成功的主要影响因素[1]。本研究对这些影响因素进行分析,试图通过培养体系的改进而探索更好的口腔黏膜上皮细胞的体外培养方法。
1材料和方法
1.1组织来源
2004年10月—2005年6月于吉林大学口腔医院口腔颌面外科取唇裂修复术、智齿拔除术和鳞癌手术切除的口腔黏膜正常组织24例,患者年龄6个月~76岁。其中,鳞癌患者的正常黏膜取自手术切除组织的边缘,并经病理切片证实无上皮异常增生,也未发生癌变。
1.2主要试剂
分离酶Dispase和角化细胞无血清培养液(keratinocyte-serum free medium,K-SFM)(Gibco公司,美国);胰蛋白酶(上海生物工程有限公司);胎牛血清(天津灏洋);鼠抗人广谱单克隆角蛋白抗体AE1/AE3及SP免疫组化试剂盒(福州迈新);其余试剂均为国产分析纯。
1.3主要仪器和器材
CO2饱和湿度细胞培养箱(Napco公司,美国);倒置相差显微镜(Olympus公司,日本);超净工作台(苏州净化设备厂);一次性细胞培养板和培养皿(NUNC公司,丹麦);0.22μm微孔滤器(Corning公司,美国)。
1.4方法
1.4.1标本处理 无菌条件下所取的口腔黏膜组织立即保存于D-Hank′s液中,半小时内运送至细胞培养室。超净台内组织标本经PBS洗净血迹,0.06%的新洁尔灭(苯扎溴铵)溶液浸泡2 min,再用含有硫酸庆大霉素的PBS(2g/L)依次浸泡10min、3min和2min。处理后的标本经眼科剪剪去部分黏膜下组织,并修剪成0.3 cm×0.8 cm大小的组织块。
1.4.2黏膜上皮的分离 所有黏膜组织被随机分为2组。一组黏膜标本放入0.25%的Dispase中,另一组黏膜标本放入0.40%的Dispase中,2组均置于4℃下消化22 h。取出后用眼科镊分别夹持标本的上皮层和上皮下层,将上皮分离下来,弃去上皮下层。经3位实验者完成操作,并一致确认每例标本上皮分离的结果,评判标准如下。①有分离作用:标本的上皮被完整或部分分离下来;②完整分离作用:每块标本的上皮均被完整分离下来;③无分离作用:每块标本的上皮均不能分离下来。分别记录每组有上皮分离作用的例数,计算分离率。分别记录每组有完整分离作用的例数,计算完整分离率。比较2组分离率和完整分离率。
1.4.3上皮细胞的培养 原代培养方法:上皮经PBS冲洗后加入到0.125%胰蛋白酶与0.01%EDTA(1∶1)的混合消化液中37℃下消化5~10 min(2 min振荡1次),轻轻吹打,用含10%胎牛血清的D-Hank′s液终止消化,用吸管吹打成细胞悬液,经200目无菌尼龙滤网过滤。PBS洗涤2遍,离心500 r/min×10 min。细胞沉淀在K-SFM中重悬,血球计数板计数。细胞悬液以2.5×105个/cm2的密度接种于培养板中,置37℃5%CO2细胞培养箱中静置培养。第3天首次换液,培养液移入新孔中使未贴壁细胞继续贴壁。以后隔天换液1次。
传代培养方法:当细胞达到80%~90%汇合时,吸去培养液,0.25%胰蛋白酶与0.02%EDTA(1∶1)的混和消化液消化细胞,至镜下观察细胞突起回缩,细胞变圆时终止消化,吸管反复吹打,离心800 r/min×8 min,K-SFM重悬细胞沉淀,细胞悬液以1∶2的比例接种于培养板或培养皿中继续培养,以后隔天换液1次。
1.4.4细胞形态学观察 采用倒置相差显微镜观察细胞形态变化及生长增殖情况并拍摄照片。
1.4.5免疫细胞化学染色 取第2代细胞制细胞爬片,PBS洗涤3次后,4%的多聚甲醛溶液固定30 min,0.3%Trtion-100室温下处理10 min。用广谱单克隆角蛋白抗体及SP免疫组化试剂盒按试剂盒说明书进行免疫组化染色。以正常口腔黏
您可能关注的文档
最近下载
- DB5301_T 90-2023 工程建设项目联合测绘 技术规范.pdf VIP
- 2023年湖南岳阳市第一中学高一上入学考试数学模拟试卷附答案解析.pdf VIP
- 建立良好师生关系促进教育教学.pptx
- 2025年辅警招聘考试公安基础知识(情景分析题)模拟试卷3(题后含答案及解析.pdf VIP
- 中建一局首都体育学院项目临电方案(终)(28P)2.pdf VIP
- 无领导小组讨论几个派别、无领导小组讨论角色、无领导小组讨论面试十大精准切点、无领导小组讨论答题技巧、无领导小组讨论的加分项.docx VIP
- 《无人机基础》课件.pptx VIP
- 工程增项申请表格.docx VIP
- 2021利达JB-QG-LD988EL JB-QT-LD988EL 火灾报警控制器 消防联动控制器调试手册.docx VIP
- 实验动物学发展的趋势.ppt VIP
文档评论(0)