蛋白质分离纯化综述.pptVIP

第七章 蛋白质的分离  纯化和表征 第一节 蛋白质的酸碱性质 第二节 蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀 第三节 蛋白质分离纯化的一般原则 第四节 蛋白质混合物的分离方法 第五节 蛋白质分子量的测定 第六节 蛋白质含量的测定与纯度鉴定 第一节 蛋白质的酸碱性质 蛋白质是两性电解质，是多价的。 解离基团——侧链基团（主要）， 末端α—COOH和α—NH3 （次要） 。 蛋白质的等电点（pI） 等离子点 第二节 蛋白质的胶体性质 与蛋白质的沉淀 水化层和双电层 影响蛋白质沉淀的因素 沉淀蛋白质的方法： 盐析法 有机溶剂沉淀法 等电点沉淀法 重金属盐沉淀法 生物碱试剂和某些酸类沉淀法 加热变性沉淀法 第三节 蛋白质分离纯化的一般原则 纯化的最终目标：增加纯度或比活性，并使产量达到最高值。 前处理 粗分级 细分级 第四节 蛋白质混合物的分离方法 利用溶液度差别的分离方法 根据分子大小不同的分离方法 根据电荷不同的分离方法 蛋白质与其它化合物的专一或非专一相互作用 利用溶液度差别的分离方法 1.等电点沉淀：（isoelectric precipitation） 2. 蛋白质的盐溶和盐析（Salting out） 3. 有机溶剂分级法： 4. 温度对蛋白质溶解度的影响： 二.根据分子大小不同的分离方法 透析（dialysis）和 超过滤（ultrafiltration）： 密度梯度（区带）离心： 凝胶过滤层析（分子排阻层析、分子筛层析、凝胶渗透层析） （gel filtration） ： 三.根据电荷不同的分离方法 离子交换层析： 电泳： 聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE） （等）电聚焦（IEF）： SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 单体：丙烯酰胺，甲叉双丙烯酰胺 增速剂：TEMED（N,N,N’,N’-四甲基乙二胺）、3-二甲胺丙腈 引发剂：过硫酸铵、过硫酸钾、核黄素 特性：机械性能、弹性、透明度、粘着度、孔径大小 蛋白质与其它化合物的专一 或非专一相互作用 亲和层析（Affinity chromatography） 吸附分离 疏水层析 第五节 蛋白质分子量的测定 方法： 根据化学组成测定最低分子量 利用凝胶过滤法测定分子量 公式：Ve－Vo = a－b logM logM = K1－K2Ve 利用SDS—PAGE法测定分子量 公式： logM = K1－K2μR 4.质谱法 5.通过渗透压测定蛋白质分子量 第六节 蛋白质含量的测定与纯度鉴定 含量： 凯氏定氮法（Kjeldahl） 双缩脲法（biuret） Follin—酚法（Lowry） 紫外吸收法 染料结合法（Bradford） BCA法： BCA分子式： 原理图： 纯化过程中需要测定： 总蛋白，总活力，比活力，纯化倍数（以比活力计算），回收率（以总活力计算）。 测定蛋白质的活性 纯度鉴定： 电泳法 沉降法 HPLC 溶解度分析 Affinity chromatography High Pressure Liquid Chromatography R O O O O O O O O H H H H H H H H H H H + N N N N N N N N N C C C C C C C C C C C C C C C C C C O O - R R R R R R R R 1 Biruet Methods (carbonyl) 2 Cu+ Phosphomolybdic- phosphotungstate C OH.. Lowry Methods 280 nm (aromatic) Coomassie Brilliant Blue G -N=N- -NH- -OH -SO3- SO3- SO3- -N=N- -NH- -OH -SO3- SO3- SO3- ■ 各 种 蛋 白 质 定 量 法 原 理 ： ■ 各 种 蛋 白 质 定 量 法 原 理 ： Tyr UV Absorbance Cu2+ Cu+ 3 4 Coomassie Brilliant Blue G-250 加入蛋白质 酸性环境下呈茶色 CBG 是一种指示剂 470 nm 595 nm Bradford Method： 精 确 准确 不精 确+不准确 280 nm 吸光度 Biuret Method Lowry Method Bradford Method 透析（dialysis） Ultracentrifugation Gel fil