蔗糖酶米氏常数的测定综述.pptVIP

【目的】：了解底物浓度与酶反应速度间的关系，学习求蔗糖酶米氏常数的方法 【原理】：米氏方程式 v = 米氏常数的求法很多，最常用的是Lineweaver—Burk的作图法(双倒数作图法)。 米氏方程式可改写为下列倒数形式： 选择不同的[s]，测定相应的v，求出两者的倒数，以1/[s]为横坐标，以1/v为纵坐标作图，绘出一条直线，外推至横轴相交，横轴截距即为-1/Km。 蔗糖酶米氏常数的测定 Vmax[S] Km +[S] [S] 1/2VMAX v VMAX Km 底物浓度与反应速度关系曲线 Vmax?[S] V= Km + [S] 还原糖与3,5-二硝基水杨酸(DNS)试剂反应： 【仪器与试剂】 1. 仪器：分光光度计、恒温水浴、试管、吸管、秒表、坐标纸 2．试剂 标准葡萄糖溶液（1 mg/mL） 3%蔗糖溶液（87.7 mM） 0.2 mol/L NaAc缓冲溶液（pH4.6） 0.5 mol/L NaOH溶液 3,5-二硝基水杨酸试剂 【操作步骤】 1．葡萄糖标准曲线的制定 管号 0 1 2 3 4 5 葡萄糖标准液(mL) 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 蒸馏水(mL) 2.0 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0 3,5-二硝基水杨酸试剂(mL) 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 将各管溶液混合均匀，在沸水浴中加热5min，取出后立即用冷水冷却至室温，以蒸馏水稀释至25mL，摇匀。测540nm处A值。以葡萄糖含量（mg）为横坐标，A值为纵坐标作出标准曲线。 取试管8支编号，按下表将蔗糖溶液，醋酸缓冲液分别加入试管，于37℃水浴中保温10min。一定量酶液同一水浴中保温约10min。 于各管中依次按同样间隔(0.5min)加入已保温过的酶液1.0mL，计时，立即摇匀，在37℃中准确温浴5min。 按同样次序和时间间隔，加入1mL 0.5mol/L NaOH，摇匀，终止反应。 吸取反应物1.0mL，加入盛有3.0mL 3，5-二硝基水杨酸试剂和1.0mL水的试管中混匀，放入沸水浴中加热5min，冷却后稀释至25mL，摇匀，在540nm比色测定A值。 以A值对应的葡萄糖量为相对反应速度，以1/[S]为横坐标，1/v为纵坐标作图，由图求出Km值。 2．底物浓度和初速度υ测定 反应物 终止反应 活力测定 数据处理 管 号 3% 蔗糖液 (mL) 醋酸缓 冲液(mL) 酶液 (mL) 1mol／L NaOH (mL) 吸取反 应物 (mL) 水杨酸 试剂 (mL) 水 (mL) A540 υ 底物浓度 1/[s] 1/υ 1 2 3 4 5 6 7 8 0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.75 5.0 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 25 0 1.0 1.0 1.0 1.0 0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0