[浙江大学生物化学实验甲奥赛-质粒DNA的小批量提取与酶切鉴定.pptVIP

质粒DNA的提取与酶切鉴定 （一）质粒DNA的提取与电泳鉴定 1、质粒简介 质粒是一种寄生性的自主复制子，存在于细菌等细胞中，为双链闭环的DNA分子，大小为1kb~200kb之间，具有自主复制和转录的能力，但其复制和转录要利用宿主细胞（细菌）编码的一些酶和蛋白质。 2、分离纯化质粒的原理 分离纯化质粒DNA主要是利用宿主细菌DNA与质粒DNA之间的差异来进行的。 （一）质粒DNA的提取与电泳鉴定 细菌DNA与质粒DNA形状上均为双链环形，但二者的分子量相差较大，细菌DNA的分子量在109D左右，而质粒DNA的分子量仅为106 ~107D， 提取纯化质粒的过程中，细菌DNA大多断裂成线状分子，而质粒DNA则多数仍为双链环状，从而即可将二者分开。 本试验采用微量碱变性法来分离纯化质粒DNA，具体的分离纯化原理如下： 0 （一）质粒DNA的提取与电泳鉴定 质粒DNA的天然结构为共价闭环（超螺旋）结构，但在制备过程中，由于各种因素的影响，同一质粒DNA的分子可能呈现出如下几种构型： ①超螺旋型（共价闭环）质粒DNA：（cccDNA）超螺旋状。 ②开环质粒DNA：（ocDNA）质粒DNA的两条链中有一条链发生一处或多处断裂，从而形成松弛的环状分子。 ③线状质粒DNA：（linearDNA）质粒DNA的两条链在同一处断裂，从而变为线状分子。见图1 （一）质粒DNA的提取与电泳鉴定 电泳时，由于分子形状的不同，三种质粒DNA的泳动行为不同，根据电泳迁移率从小到大的顺序分别为开环质粒DNA、线状质粒DNA和超螺旋质粒DNA。 3、DNA的琼脂糖凝胶电泳鉴定原理 核酸是一种两性电解质（碱基、磷酸），在pH8.0下，核酸带负电荷，电泳时向正极移动，根据核酸分子所带电荷的多少，分子的大小及构型的差异，可用电泳的方法对核酸进行分离和鉴定。 （一）质粒DNA的提取与电泳鉴定 电泳中所使用的支持介质有聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶，核酸中常用琼脂糖凝胶。 不同浓度的琼脂糖凝胶可以分离200bp~50kb的DNA片断，通过在琼脂糖溶液中加入低浓度的莹光染料溴乙锭（EB），在紫外光下即可检测出10ng的DNA条带。 当用琼脂糖凝胶电泳法检测质粒DNA样品时，根据条带的位置即可知道质粒DNA的三种构型及其比例。 （一）质粒DNA的提取与电泳鉴定 此外，还可了解质粒样品中的杂质，如RNA、染色体DNA、蛋白质等的污染程度。电泳时如用已知分子量的核酸作对照，还可测定样品核酸的分子量。 4、材料与试剂 ⑴、试验材料 本实验所用质粒为重组的pBSKS质粒。其中质粒pBSKS来源于大肠杆菌，其物理图谱见图1.2。 （一）质粒DNA的提取与电泳鉴定 经在BamHⅠ和HindⅢ切点间连接上一个大小为1.7kb的片段，即成为重组的pBSKS质粒。见 图1.3 。 ⑵、试验试剂 试验试剂及使用时的注意事项解说详见P144及P147。 标准核酸的分子量见图1.4。 5、操作步骤 ⑴、质粒的提取 （一）质粒DNA的提取与电泳鉴定 质粒提取的操作方法及注意事项解说详见P145。 ⑵、电泳鉴定 胶浓度：0.7~0.8% 上样量：5ul质粒+1ul上样缓冲液 各步操作方法及注意事项解说详见P148。 6、实验结果及处理 仔细观察纯化过程中各步试验现象。 仔细观察电泳后荧光带的显示情况，据此绘制电泳图谱并对图谱进行简要说明。 （二）、质粒DNA的酶切鉴定 1、限制性内切酶简介 限制性内切酶或限制性核酸内切酶（Restriction Enzyme or Restriction Endonuclease）是指能辨认双链DNA分子中的特异碱基序列，并在此序列处以内切方式将DNA双链同时切断的一类酶。 根据它们的作用特点，可将其分为三类：Ⅰ类和Ⅲ类酶，在同一种酶分子中兼有切割和修饰（甲基化）作用，Ⅰ类酶由于切割位点随机，Ⅲ类酶则由于切割位点不对称，因此这两类酶的作用都不大。 （二）、质粒DNA的酶切鉴定 Ⅱ类酶由两种酶组成，一种为限制性核酸内切酶，另一种为独立的甲基化酶。其中，对我们最为有用的是Ⅱ类酶中的限制性核酸内切酶。 限制性核酸内切酶广泛存在于原核生物中，1970年由H.O.Smith等从流感嗜血菌中最先分离得到。现已发现近几百种(498种)。 该类酶能识别DNA分子中的特异序列，并在此序列处切断DNA双链。 （二）、质粒DNA的酶切鉴定 绝大多数限制性内切酶的识别序列为4个~6个碱基对，该序列具回文对称结构，且富含GC。（即旋转1800后与原来结构相同），少数酶可识别更长的序列或兼并序列。 限制性内切酶切割后的DNA片断，有的产生粘性末端，有的产生平末端。如： ⑴、产生粘末端的酶 （二）、质粒DNA的酶切鉴定 BamHⅠ：G G A T C C