植物基因工程操作论文..doc

瓜叶菊Mlo基因片段的克隆 摘 要（Powdery Mildew）制约瓜叶菊产业发展的重要病害之一。白粉病的环境污染。Mlo基因，可能参与瓜叶菊白粉病的调控过程与显性R基因控制的抗病基因不同，它是由单基因控制的隐性抗病基因，具有非小种专化的持久抗性，其功能类似于G蛋白偶联受体 。Mlo基因可能对细胞坏死具有负调控作用，即抑制细胞坏死，类似于其它突变体基因以寄主死亡来抵抗病原菌的入侵，Mlo基因突变为mlo基因后，对细胞死亡的负调控作用被解除，被侵染细胞可能更易死亡，由此引发广谱的抗病性。Mlo基因进行诱变而获得抗性。这种抗性，即便是在粗放的栽培管理条件下，也可以在田间得到持久保存，即便没有病原菌的侵染，突变的mlo植物也表现出自身细胞壁加固（cell wall appositions，CWAs）和叶细胞的自发死亡现象。因此，对该基因的克隆以及结构和功能的研究，为瓜叶菊的抗病育种奠定了基础并提供了新思路。Pericallis hybrida B. Nord.）为试材，通过PCR方法克隆了Mlo基因cDNA序列，并采用生物信息学方法对其进行预测和分析，为进一步研究瓜叶菊Mlo基因的功能和表达情况提供了理论依据。 关键词: 瓜叶菊；Mlo基因1.研究的目的及意义 在温室生产的条件下，白粉病（Powdery Mildew）逐渐成为瓜叶菊（Pericallis hybrida B. Nord.）栽培的主要病害，发病后严重影响瓜叶菊的生长发育和观赏性能，随着元旦、春节人们对于盆栽早春瓜叶菊需求的逐年增加，目前瓜叶菊白粉病已成为制约瓜叶菊产业发展的重要病害之一。迄今为止, 化学杀菌剂是目前防控白粉病的主要手段，但又往往损伤叶片和花朵，影响了观赏价值和带来环境污染[1]。在生产上，主要通过常规杂交选育的方法培育抗白粉病瓜叶菊品种，可是白粉病原菌快，导致抗病往往落后于小种更替[2]近年来，人们采用RNA干扰MLO(Mycoplasma-like Organism)基因技术进行白粉病防治取得一定进展[]，如果该技术应用于瓜叶菊白粉病防治上，那么有望从根本上解决防控白粉病的问题。 瓜叶菊白粉病的Mlo基因防治机理认识还不是十分清楚，但是在大麦、番茄等作物上有研究表明，新型抗病基因，Mlo抗性的负调控因子[5,6]。即使没有病原菌存在时携带mlo突变的大麦引发自发性的细胞坏死细胞坏死野生Mlo基因可能负调控作用，即抑制细胞坏死[,8]。缺失或移码Mlo基因突变成为mlo后，正常功能的MLO蛋白不能合成，因此解除负调控作用，叶表皮细胞积累抗真菌活性的酚类物质以及H2O2和O2-，H2O2能够直接杀死，从而加固细胞壁，广谱抗病性[]。 本实验以瓜叶菊（Pericallis hybrida B. Nord.）为试材，采用 RT-PCR 和 RACE 方法克隆了Mlo基因cDNAMlo基因的功能和获得具有广谱和持久的白粉菌抗性的瓜叶菊种质资源奠定基础。 2 材料与方法 2.1 实验材料 2.1.1 Pericallis hybrida B. Nord.）由东北农业大学园艺实验站提供，取样液氮速冻保存于-80℃冰箱中备用。 2.1.2TRIZOL购自Invitrogene公司总RNA抽提试剂盒北京天根第一链cDNA合成试剂盒PCR扩增试剂盒DNA凝胶回收试剂盒北京全式金，其它生化试剂均为进口或国产分析纯产品。 2.1.大肠杆菌（E. coli）菌株5α、TransT1购置于北京全式金，克隆载体pMD18 T-Vector购置于TaKaRa公司 2.2 实验方法 2.2.1 瓜叶菊Mlo基因片段的克隆及序列预测分析 瓜叶菊RNA的提取 方法一：TRIZOL法提取RNA （1）剪取100~200叶片，液氮研磨后，置入1.5ml离心管中，加入lm1TRNzol Reagent试剂，振荡lmin，室温放置5~10min； （2）4℃，12000r/min，离心10min，去除沉淀； （3）取上清，并将其液移入一新的离心管，加入等体积的氯仿1:1），剧烈振荡30sec，室温静置2~3min； （4）4℃，12000r/min，离心10min样品分成三层：黄色有机相，中间层和上层无色的水相，RNA主要在水相中，把水相转移到新的离心管中； （5）加入等体积的异丙醇，室温沉淀10~30min； （6）4℃，12000r/min，离心10min，沉淀RNA； （7）去上清，加入lm175%的乙醇DEPC处理过的水配制清洗，4，7500r/min，离心5min重复一次室温晾干 （9）加入50μl无ase的灭菌双蒸水，溶解RNA； （10）260mn下测OD值定量RNA浓度； 方法二：参照北京天根总RNA抽提试剂盒说明书 将GeneBank上登录的外源植物核苷酸及氨基酸序列进