酶联免疫吸附试验-生20140113题库.pptVIP

实验一 酶联免疫吸附试验(ELISA) 抗原 抗体 抗原抗体反应 Hv Lv Hc Lc Ⅰ 抗原抗体反应的特征 “Lock and Key” 模式: 高度特异性 非共价键结合 氢键、静电引力、范德华力、疏水键 可逆性结合 亲和力；亲合力 抗原抗体比例 抗原的理化性质 温度: 37℃~56℃ PH值: 6~8 离子浓度: 0.9% NaCl Ⅱ 影响抗原抗体反应的因素 凝集反应 沉淀反应 补体结合反应 中和反应 Ⅲ 经典抗原抗体反应 免疫标记技术 定义： 将抗原-抗体反应与标记技术相结合，用放射性同位素、酶或荧光素标记的已知抗体或抗原，通过检测标记物，间接测定未知的抗原或抗体。 分类： 放射免疫测定法：131I，32P 免疫荧光技术：FITC(异硫氰酸荧光素)，PE(藻红蛋白) 免疫酶测定法：HRP，AP 免疫酶测定法(Enzyme ImmunoAssay,EIA) 用酶标记的抗原或抗体进行的抗原抗体反应。 辣根过氧化物酶(HRP)，碱性磷酸酶(AP) 特点： 高度特异性：保持抗原抗体反应的特异性 高灵敏度：酶催化底物显色的高效性，pg水平微量检测 定性定量检测：反应液颜色深浅或光密度值 分类： 酶联免疫吸附试验：可溶性抗原或抗体 酶免疫组化法： 组织中或细胞表面的抗原。 酶联免疫吸附试验(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay,ELISA) 用酶标记抗原或抗体检测液体（血液、细胞液）中未知抗体或抗原的方法。 1.定义 2.分类 间接法（Indirect ELISA）： 将已知抗原吸附于固相载体，酶标记二抗 检测液相中未知抗体 双抗体夹心法（Sandwich ELISA)： 将已知抗体吸附于固相载体，酶标记一抗 检测液相中的可溶性抗原 竞争法（Competitive ELISA) ： 将已知抗体或抗原吸附于固相载体，酶标记抗原或抗体 检测液相中的可溶性抗原或抗体 酶联免疫吸附试验(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay,ELISA) 3. 原理（以双抗体夹心法为例）： 显色 抗体 待测抗原 酶标抗体 E E 结果判定： 定性检测 定量检测 定量检测： 实验内容： 双抗体夹心法测定乙肝表面抗原 实验材料 包被板：已包被抗-HBs的酶标板 酶结合物：酶标记抗-HBs 底物液： OPD 10mg，底物缓冲液25ml，30% H2O2 40μL 显色剂： 洗涤液：含0.05% Tween 20的0.01M pH7.4 PBS 终止液：2% H2SO4 阴性对照 阳性对照 取出包被好抗体的酶标板，室温平衡（7孔/组） 加待测血清 标记各孔，加入稀释液体20μL/孔 1 2 3 4 阴性 阳性 加二抗： 各孔加入相应试剂100μL/孔,轻轻震荡混匀 37℃，湿盒内，45mins,甩干孔内液体 加入底物并显色： 弃净上清，以洗涤液（200μL/孔）洗涤6次，1min/次，每次扣干残液 加入底物溶液50μL/孔，混匀 37℃，避光显色， 30min 观察结果 实验方法 空白 实验 加入终止液50μL/孔 酶标仪检测450nm波长下OD值，如果为定性肉眼观察即可 加酶 每孔加入酶标抗体50ul,混匀后， 温育 37℃温育30min 注意事项： 标本的采取和保存：根据不同标本保存和处理 准备试剂：一定要按试剂盒说明书进行 加样：要准确 保温时间：每次试验要保持一致 洗涤：要充分 个人保护 * 在上面两次试验中，应用抗原抗体特异性结合反应的原理，进行了凝集反应、沉淀反应的等经典的血清学反应。 然而，这些实验在结果分析时，常常采用肉眼观察的方法，进行定性、半定量的检测，存在主观因素的影响，而且难以进行微量抗原、抗体的检测。因此，人们希望引入其他的技术，在不影响抗原抗体反应的前提下，提高检测的灵敏度和准确性。 免疫标记技术的兴起，使得这种想法得以实现。 随着分子生物学、细胞生物学、基础免疫学和免疫化学等学科的进展以及应用现代高新技术建立的仪器分析日趋发展，免疫标记技术也不断完善和更新。各种新技术和新方法不断涌现，至今已发展成为一类检测微量和超微量生物活性物质的免疫生物化学分析技术。在医学和其他生物学科的研究领域及临床检验中应用十分广泛。  * Understanding Antigen:Antibody Interactions Important for understanding the immune response. Many antibody based therapies are making their way intoclinical use. Many research tools utilize antigen: antibody inter