引致猪繁殖障碍病的6种病毒低密度基因芯片检测方法的建立..docVIP

引致猪繁殖障碍病的6种病毒低密度基因芯片检测方法的建立 高淑霞1,3 吴时友2 庄文忠4 尹燕博2 牛钟相3* 摘要 应用PCR（或RT-PCR）分别扩增猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒、猪伪狂犬病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒-2型、日本乙型脑炎病毒和猪瘟病毒的一段保守序列，克隆到pMD 18-T Simple Vector构建重组质粒，用于制备各病毒的探针。将各探针按一定的阵列点硝酸纤维素膜上后加以固定，制备低密度检测基因芯片。在多重PCR扩增过程中用生物素标记的dUTP(Bio-11-dUTP)对待检样品进行标记，扩增产物与芯片杂交，用扫描仪对杂交结果进行扫描分析。应用该检测方法可以同时检测到待检样品中上述6种病毒核酸的存在与否，达到鉴别诊断的目的。 关键词 繁殖障碍 基因芯片 多重PCR 核酸杂交 目前,我国猪传染病流行的主要特点是：多病原混合感染，繁殖障碍性传染病普遍存在，呼吸道传染病日益突出。猪繁殖障碍的主要临床症状为：母猪不孕、早产、产死胎、木乃伊胎和弱胎等。引繁殖障碍有：猪繁殖与呼吸综合respiratory syndrome virus)、伪狂犬病、猪细小病毒virus)、猪圆环病毒型、日本乙型脑炎apanese B encephalitis virus)和猪瘟病毒(CSFV, classical swine fever virus)、猪流感病毒（SI, swine influenza virus）。其它病原体还有猪布鲁氏杆菌、猪衣原体、猪钩端螺旋体和附红细胞体等。一旦发生繁殖障碍性疾病，难以在临床上确诊，而且多为多病原体混合感染，更增加了诊断难度，必须借助实验室方法。 针对上述情况，本研究采用近年来发展的基因芯片技术，建立引致猪繁殖障碍的6种病毒（PRRSV、CSFV、PCV2、PPV、PRV、JEV）低密度基因芯片检测方法。本方法借助多重PCR、核酸杂交以及酶标技术建立一种一次多元的检测方法。利用该方法可以对混合感染样本中的6种病毒进行快速、准确的检测，到同时达到鉴别诊断的目的。本检测方法可以用于实验室诊断、大面积的疾病流行病学调查以及动物及动物食品的检验检疫。 1 材料与方法 1.1材料 1.1.1毒株 PRRSV、CSFV、PCV2、PPV、PRV、JEV毒株购自中监所。 1.1.2菌种 受体菌E. coli JM109由山东pMD 18-T Simple Vector、T4 DNA ligase购自大连宝生物。DNA recover kit购自V-gene生物技术有限公司。硝酸纤维素膜为MILLIPORE产品。 1.2方法 1.2.1引物设计 根据Genbank以发表的病毒核酸序列，应用Oligo6.0设计各病毒的特异引物，由上海赛百盛合成。各病毒、引物序列以及扩增片段长度见表1。 表1引物设计的病毒、引物序列及扩增片段长度 Table 1 virus, primer sequence and product length 病毒 virus 引物序列 primer sequence 扩增片段长度 product length bp PRRSV 5’-cgc aca ggc tgt gcg aga aaa-3’ 5’-gat gcg aga tca gct tca agg-3’ 255 CSFV 5’-gct cct ggt tgg taa cct cgg-3’ 5’- tga tgc tgt cac aca ggt gaa-3’ 508 PCV-2 5’-tgg ctg ccc tgg gat gat cta-3’ 5’-tcc tac cac tcc cgc tat ttc-3’ 565 PPV 5’-gca gta cca att cat ctt ct-3’ 5’-tgg tct cct tct gtg gta gg-3’ 588 PRV 5’-ccg cgg gcc gtg ttc ttt gt-3’ 5’-gtc cac cgg gcg cag gca ctc g-3’ 300 JEV 5’-cat tcc aag cga agc agg aga tcc-3’ 5’-gac gtc caa tgt tgg ttt gtc g-3’ 375 1.2.2 重组质粒的构建 采用PCR或RT-PCR获得病毒核酸的DNA或cDNA片段，纯化回收后用pMD 18-T Simple vector构建重组质粒,转化大肠杆菌JM109感受态细胞,筛选阳性克隆,进行PCR及测序鉴定。 各阳性质粒分别记作pMD18-PRRS、pMD18-CSF、pMD18-PC2、pMD18-PP、pMD18-PR、pMD18-JE。 1.2.3芯片的制备 1.2.3.1探针的制备