生化大实验报告.docx

生化实验报告[键入文档副标题] 实验一 多酚氧化酶（PPO）的分离与提取一、实验目的1、本实验以马铃薯为主要的实验材料，通过细胞组织破碎匀浆、过滤、离心、硫酸铵沉淀、透析等步骤获得PPO的粗酶液。2、通过本项实验，学习和了解蛋白质的提取、分离的基本原理和方法，掌握相关仪器设备的操作使用，以及蛋白质的提取、分离的系统技术。二、实验原理多酚氧化酶是植物组织内广泛存在的一种含铜氧化酶，位于质体、微体内，参与植物抗体的调节，属于末端氧化酶的一种。在植物体受到机械损伤和病毒感染后，PPO催化酚与氧氧化成醌，使组织形成褐变，对PPO弄得的测定便是通过PPO氧化酚产生醌的变色反应测定其酶活性。在蛋白质水溶液中，加入少量的中性盐，如硫酸铵、氯化钠等，会增加蛋白质分子表面的电荷，增强蛋白质分子与水分子的作用，从而使蛋白质在水溶液中的溶解度增大。这种现象称为盐溶；而在蛋白质水溶液中继续加入无机盐类可以其溶解度降低而析出的过程，该现象称为盐析。蛋白本身随盐浓度的溶解度变化曲线具有特征性，可以依据此分离蛋白，硫酸铵分级便依据此原理，首先在蛋白质溶解度最高时，离心取上清，去除此时未溶解或已经沉淀的杂蛋白，之后再其溶解度最低且未变性的时候离心取沉淀复溶，去除尚未析出的杂蛋白，从而达到纯化目的蛋白的目的。多酚氧化酶在40%硫酸铵溶液中溶解度最高，而在75%硫酸铵溶液中沉淀量最高，由此可分离提取多酚氧化酶。但使用硫酸铵分级，分离后的产物中会有铵根离子残留，如果采用凯氏定氮法测定蛋白质浓度时，残留的铵根离子会造成测定时高于实际值，同时该样品之后会用于离子交换层析纯化，所以需要去除其中的离子，故需要透析去除其中铵根离子。多酚氧化酶提取在PH6.0的中性偏酸条件下进行，在此PH值下，磷酸缓冲液的缓冲能力最强，故选择使用其作为缓冲液，其中加入的EDTA为螯合剂，聚乙烯比咯烷酮是用于吸附醌，本身为固体颗粒，不需要溶解。三、仪器与试剂：（1）马铃薯200g（2）试剂：溶液A：0.03M磷酸缓冲液PH6.0（内含0.02M巯基乙醇，0.001MEDTA，5%甘油，1%的聚乙烯 比咯烷酮）固体硫酸铵溶液B：0.03M磷酸缓冲液PH6.0（内含0.02M巯基乙醇，0.001MEDTA，0.005M 氯化镁）实验器械与仪器设备：烧杯，玻璃棒，量筒，天平，高速冷冻离心机，离心杯，透析袋，植物组织匀浆器，过滤纱布。四、实验步骤：1、将马铃薯切削块，按照1g:1ml的比例加入0.03M磷酸缓冲液，放入植物组织匀浆器，将马铃薯充分粉碎使PPO从细胞中释放出来。2、将处理过的溶液用四层纱布过滤，去除溶液中的大颗粒固性物质，装离心瓶配平后，12000转离心10min。3、离心后取上清液162ml，查表知欲得到0℃硫酸铵40%饱和度需要加入无水硫酸铵29.92g，称量加入溶液中，用玻璃棒轻轻搅拌，避免因为机械剪切导致蛋白变性，0℃静置一小时。4、静置一小时后，装离心瓶，调平后离心机12000转离心10min，弃沉淀得上清液192ml，查表知欲得0℃硫酸铵75%饱和度需要再加无水硫酸铵35.90g，称量后加入，用玻璃棒轻轻搅拌，0℃静置2小时沉淀。5、将透析前样品抽500ul作为粗酶样品。6、两小时后，装离心瓶，调平后12000转离心10min，弃上清液，沉淀加10ml溶液B复溶，装透析袋绑好透析过夜。实验二 离子交换柱层析纯化多酚氧化酶（PPO）及活性测定一、实验目的1、本实验拟通过离子交换层析分离纯化PPO的操作，掌握该层析的基本原理、运用及操作技术。2、通过纯化PPO检验之前提取PPO的实验是否成功。3、通过本实验学习并掌握传统的蛋白质活性及浓度测定的方法、原理及相关仪器设备的操作。二、实验原理离子交换层析是依据各种离子或离子化合物与离子交换剂的结合力不同而进行分离纯化的。离子交换层析的固定相是离子交换剂，它是由一类不溶于水的惰性高分子聚合物基质通过一定的化学反应共价结合上某种电荷基团形成的。 离子交换剂可以分为3部分；高分子聚合物基质、电荷基团和平衡离子。电荷基团与高分子聚合物共价结合, 形成一个带电的可进行离子交换的基团。平衡离子是结合于电荷基团 上的相反离子,它能与溶液中其他的离子基团发生可逆的交换反应。平衡离子带正电的离子交换剂能与带正电的离子基团发生交换作用, 称为阳离子交换剂；平衡离子带负电的离子交换剂与带负电的离子基团发生交换作用,称为阴离子交换剂。离子交换反应可以表示为；阳离子交换反应: ( R—X - ) Y + + A + ( R—X - ) A + + Y + 阴离子交换反应: ( R—X + ) Y - + A - ( R—X + ) A - + Y - R代表离子交换剂的高分子聚合物基质, X - 和 X + 分别 代 表阳离子交换剂和阴离子交换剂中与高分子聚合