生化大实验实验报告2.doc

生 化 大 实 验 实 验 报 告 姓 名： 王国宾 学 号：82101132325 班 级：硕士九班 实验班级：一班 专 业：农药专业 实验一：多酚氧化酶(PPO)的分离提取 一、实验目的 通过本项实验，学习和了解蛋白质的提取、分离的基本原理和方法，掌握相关的仪器设备的正确使用的方法，以及蛋白质的提取分离的系统技术。 二、实验原理： 1.蛋白质在不同浓度的盐溶液中的的溶解度不同，通过向溶液中加入适量的固体硫酸铵来调节粗提液的盐浓度从而将PPO蛋白从体系中析出。 2.大分子蛋白质不能通过透析膜。 三、材料与试剂 1.材料：马铃薯(约每小组100-200g) 2.试剂：0.03M磷酸缓冲液pH6.0(内含0.02M巯基乙醇，0.001MEDTA，5％甘油，1％的聚乙烯吡咯烷酮)配制时配×10倍的浓缩液1000ml；固体硫酸铵；0.03M磷酸缓冲液pH6.0(内含0.02M巯基乙醇，0.001MEDTA，0.005MgCl2)配置时配。 3.实验器械与仪器设备：试管与试管架；烧杯、玻璃搅棒；移液管、滴管等；试剂瓶；透析袋；过滤纱布；植物组织匀浆器；pH计和pH试纸；GL－20C高速冷冻离心机；DL一7A大容量低速冷冻离心机。 四、操作步骤 1.粗酶提取： 马铃薯组织按1：1(W／V)比例与0.03M磷酸缓冲液pH6.0(内含0.02M巯基乙醇，0.001MEDTA，5％甘油，1％聚乙烯吡咯烷酮)混合，匀浆后4层纱布过滤，滤液以6000rpm离心10min，弃除沉淀获得酶提取液。 2.盐析分级沉淀： 在酶提取液中加入固体硫酸铵36.45g使其达到40%饱和度,边加边搅拌使硫酸铵充分溶解，然后6000rpm离心20min弃除沉淀，离心上清液再加入固体硫酸铵30.75g达到70%饱和度，边加边搅拌使硫酸铵充分溶解，然后6000rpm离心20min，弃除上清液，收集粗酶沉淀，沉淀用0.03M磷酸缓冲液Ⅱ（内含0.02M巯基乙醇，0.001M EDTA，0.005M MgCl2,其液体pH6.0）溶解，装入透析袋中用0.02M KCl溶液透析至无硫酸根离子，获得粗酶液供上柱使用。 五、实验结果和分析 1.初提的酶液为米黄色，经过夜透析后，得到了澄清的略带黄色的液体，可以用来进一步的柱层析。 实验二：胰蛋白酶原的提取与分离 一、实验目的 本实验拟通过从猪胰脏中制备胰酶结晶实验，掌握酶的制备、一般分离、提取、纯化和结晶的操作技术。同时为亲和层析、免疫学实验准备样品。 二、实验原理 胰酶是医药、食品、饲料等工业上重要的酶抑制剂，胰酶的分离提取是普通生化实验的最主要、最经典的实验。提取制备胰酶的经典方法，多采用硫酸铵分级沉淀，胰酶在75%饱和度硫酸铵中沉淀，其他杂蛋白一般在10%硫酸铵饱和度下被沉淀而除去。经此多次提取，最后在pH8.0硼酸缓冲液中得到结晶。胰酶在pH3.0时最稳定，可在低温下储存较长时间而不失活。低于此pH，酶易变性；高于pH5.0时，酶易自容而失活。因此提取制备胰酶的全部操作过程宜在低pH和低温下进行。胰酶以无活性的酶原形式存在于动物的胰脏中。胰蛋白酶原在正常生理条件下可被肠激酶和钙离子所激活或自我活化成为有活性的酶。 三、实验材料与试剂 1.材料：新鲜猪胰脏 2.试剂： pH2.5乙酸酸化水、2.5M H2SO4溶液、2M NaOH溶液、0.1M HCl溶液、0.025M HCl溶液、0.01M HCl溶液、0.4MpH9.0硼酸缓冲液（母液为0.8M，用时稀释一倍）、Tris、硫酸铵。 四、操作步骤 1.胰蛋白酶原的提取与分离 （1）称取1-1.5Kg新鲜猪胰脏，在冰浴下剥除脂肪和结缔组织，在低温下用绞肉机绞碎胰脏后，加入2倍体积已预冷的乙酸酸化水提取。在提取过程中，是提取液维持在pH2.5-3.0之间。在冷室5℃左右搅拌提取18-24h，而后用4层纱布过滤，尽量拧挤出滤液。用50ml乙酸酸化水再提取残渣一次，时间约为1-2h，合并滤液，将滤液pH值调至2.5-3.0，放置3-5h后，收集滤液，量其总体积。 （2）盐析：加固体粉状硫酸铵进行盐析，使溶液至75%饱和度。盐析溶液放冷室中过夜，次日4000rpm离心，或用布式漏斗抽滤，滤饼经压干后称重，得到胰蛋白酶原粗制品。 2.胰蛋白酶原的激活 将胰蛋白酶原组分用10倍体积的冷蒸馏水，分多次加入使滤饼溶解，量其体积。取出1ml溶液用于测定溶液中硫酸铵的含量。因为硫酸铵可与活化剂钙离子结合，生成硫酸钙，如果钙离子过少会直接影响胰酶原的激活过程。因此按上述滤饼中含有的硫酸铵与钙结合生成CaSO4之后，尚保存0.1McaCl2慢慢加入酶原溶液中，边加边搅拌均匀。用5M NaOH溶液调节pH至8.0。