第九章杂合酶解析.ppt

第九章 杂合酶 杂合酶的定义及研究杂合酶的意义 1.定义： 由两种以上的酶成分构成，把来自不同酶分子中的结构单元或整个酶分子进行组合或交换而产生的具有所需性质的优化酶杂合体。 意义： 天然酶在现存的工业条件下稳定性较差或其催化水平很低； 天然酶在工程菌中的折叠效率较差或对蛋白酶敏感； 酶的催化活力需要扩大或减小； 需要创造具有新反应活力的酶。 第一节 杂合酶的构建策略 一、点突变及二级结构互换 二、功能域替换 三、融合蛋白 一、点突变及二级结构互换 通常杂合酶中相关酶的同源序列的互换导致酶活力的降低。 通过随机的点突变可以保持酶的活力。 蛋白酶有一个共同的靶点可用来互换底物的专一性，如产自地衣芽孢杆菌的蛋白酶和解淀粉芽孢杆菌通过互换3个残基，而交换了底物专一性，再如胰蛋白酶通过在活性部位互换4个残基转变为胰凝乳蛋白酶等。 二、功能域替换 把功能域看做是构建酶的组件，可以通过互换来构建能催化特定反应的酶。 将一个限制酶的催化中心与一个特异DNA结合结构域融合在一起可构建具有新的特异性的限制性酶。 DNA限制性内切酶Ⅱ是构建杂合酶的重要工具。 功能域转移的3种方式 第一，将一种蛋白的功能转移至同系结构蛋白上； 第二，将功能肽序列转移至宿主骨架蛋白上，而不考虑同系结构问题，目的只是限制该序列的柔性； 第三，将排列有序的活性部位转移至结构不同的适当天然骨架蛋白上。 1.转移活性部位至同系蛋白上 （1）改变底物的专一性 通过在结合底物的临近部位进行有限的氨基酸取代，可以将底物的专一性由同系基因族的一个成员转移给另一个成员。 亲缘关系较远、功能歧异的酶的专一性也可以通过有限氨基酸取代进行交换。 （2）改变辅酶专一性 根据两个酶的已知结构在结合辅酶的结构域中进行有限氨基酸的取代（交换关键功能基），可以改变酶对辅酶的专一性。 （3）改变结合活性 通过转移功能环产生新的结合活性比介入酶的活性部位更直接。 例1 根据枯草杆菌蛋白酶BPN’的结构并考虑它与真核同系物Kex2和Furin的序列差别。已知Kex2和Furin可分别裂解二碱性底物和三碱性底物。真核枯草杆菌蛋白酶BPN’中只加入两个酸性残基即可与底物的双碱性残基作用。 因此，在底物的P1(S1)、P2(S2)位置加入两个酸性残基就能有效的将专一性转移到底物的碱性残基上。 此杂合酶能有效水解人工合成底物，在 P4位置识别Arg的能力比识别Ala的能力高360倍。 如图9-2。 例2 谷胱甘肽还原酶对NADP优先作用，而硫辛酰胺脱氢酶优先作用于NAD。 根据这两个酶的已知结构，在结合辅酶的结构域中进行有限氨基酸的取代，改变酶对辅酶的专一性。 如嗜热栖热菌的异丙基苹果酸脱氢酶（IMDH)辅酶专一性的改变。 IMDH的结合DNA口袋中的β-转角在依赖NADP的大肠杆菌异柠檬酸脱氢酶（IDH）中却是α-螺旋。 因此，成功与否的关键在于能否在酶的结合部位中重建工程二级结构，即用E.coli-IDH的13个残基组成的α-螺旋取代IMDH中11个残基组成的β-转角。 工程化后的IMDH由原来对NAD优先100倍改为对NADH优先1000倍。 例3 锌指结构的共有序列可以有规律的改变结合DNA专一性。 Cys2His2锌指结构具有独特的结合DNA性质，用来自其他不同锌指结构的α-螺旋暴露于溶剂面的残基取代Cys2His2锌指结构中的7个残基就可控制锌指结合DNA的性质。 使用锌指结构的共有序列可以有规律的改变结合DNA专一性，如图9-4。 例4 血管生成素（ANG)与核糖核酸酶A的杂合体 两者有结构同源性 血管生成素的13个残基组成的表面环可以被牛胰核糖核酸酶A相应的15个残基环取代，杂合体的血管生成素能力大大降低，而核糖核酸酶活力大大增加。 而互补实验中，核糖核酸酶A的相同的15个残基表面环被血管生成素的相应13个残疾环所取代，杂合体显示出可与真正的血管生成素相比的活力，但核糖核酸酶活力降低。 如图9-5。 2.转移功能序列到呈现骨架蛋白上 将功能肽序列以插入序列形式转移到球蛋白的容许区域内，以限制构象柔性，并把这个序列呈现在受控结构中。 例如，将抗原表位插入到不同受体细菌蛋白中，作为诱导针对所选肽序列的抗体的手段，从而不必合成这个肽序列。比化学偶联得到的杂合体均一，易于用载体蛋白的特殊亲和性进行亲和层析纯化，并能通过对T细胞有专一性的决定簇刺激T细胞。 抗体的抗原化：将抗原序列插入到抗体CDR区中，作为限制其构象、提供免疫应答的手段的过程。 抗体的人源化：将CDR从一个抗体调换到另一个抗体，以便转移抗原识别专一性，降低免疫应答。 一个呈现骨架蛋白 来自大麦种子的糜蛋白酶抑制剂2。 3.转移活性部位到一个新的结构上 将结构清楚的活性部位转移到结构不相关的蛋白质上，仍保留转移部位的结构和功能。 （1）β-