纤维素酶的检测方法新..docx

纤维素酶的检测方法摘要：本文主要介绍了纤维素酶的降解原理，通过实验比较了四种常用纤维素酶的检测方法的稳定性，以及纤维素酶的发展前景，为纤维素酶的应用提供了进一步的参考价值。关键词：纤维素酶 酶活测定 葡萄糖 回归方程 一、纤维素酶及其降解原理纤维素是高等植物细胞壁的主要成分，占植物总干重的30%-50%，是地球上分布最广，含量最丰富的可再生性碳源化合物，占地球总生物量的40%。据报道，我国每年光作物秸秆，稻梗等含纤维素较丰富的物质就有5亿吨之多，全球每年通过光合作用产生的植物物质高达1.55X109吨，其中尚有89%未被人们利用，而大量的秸秆，稻梗等含纤维素丰富的物质的利用率也很低。大多采用燃烧的方式来处理，这样就造成了环境污染，破坏了土壤的理化性质和丧失了有机质成分。所以，纤维素的充分利用与有效的转化对于解决当前的能源危机，粮食短缺，环境污染等有重大意义。纤维素酶是分解纤维素的一类酶，它能将纤维素分解为葡萄糖，充分的利用了纤维素。自1906年Sellieres 在蜗牛消化液中发现纤维素酶以来，纤维素酶的研究和应用受到了国内外学者的极大关注，取得了很大进展。目前，国内外学者通过筛选产酶菌株来发酵产酶，再应用纤维素酶到食品，医药，饲料，洗涤等工业中，不仅解决了纤维素的再利用问题还取得了很可观的经济效益。纤维素酶是由许多具有高协同作用的水解酶组成的。习惯上将纤维素酶分成三种主要成分：内切酶（内切β-1,4-葡萄糖酶，也称Cx酶）、外切酶（外切β-1,4葡萄糖酶，也称C1酶）、β-1,4葡萄糖酶（即为纤维二糖酶）[1]。C1酶主要作用于天然纤维素，使之转变为非结晶的纤维素。Cx酶又分为Cx1酶和Cx2酶。Cx1酶是一种内断型纤维素酶，它从水合非结晶纤维素分子内部作用于β-（1,4）糖苷键，生成纤维糊精和纤维二塘。Cx2酶是一种外断型纤维素酶，它从水合性纤维素分子的非还原端作用于β-（1,4）糖背键，逐步切断β-（1,4）糖节键生成葡萄糖。纤维二糖酶则作用于纤维二糖，生成葡萄糖。纤维素酶在降解纤维素过程中的作用机理至今还不是很清楚。目前关于Cx酶、C1酶和β-1,4葡萄糖酶这3种酶的作用机理的假说比较公认的是以下3种，其中协同理论最为广泛接受。（1）C1-Cx假说。该理论认为首先由C1酶作用于纤维素酶的结晶区，再由外切酶和β-葡萄糖苷酶联合作用产生二糖和葡萄糖。其水解模式如图1所示。图1 C1-Cx假说示意（2）顺序作用假说。该假说认为首先由内切酶随机的作用于纤维素的葡萄糖苷键，打开缺口，然后由外切酶在新生键末端切下一个纤维二糖，再由β-葡萄糖苷酶将它水解成葡萄糖。（3）协同作用假说。该理论认为是内切葡萄糖酶首先进攻纤维素的非结晶区，形成外切纤维素酶需要的新的游离末端，然后外切纤维素酶从多糖链的非还原端切下纤维二糖单位，β-葡萄糖苷酶再水解纤维二糖单位形成葡萄糖。二、纤维素酶的检测方法纤维素酶各组分的底物专一性不同，而且纤维素酶是多组分复合物。纤维素酶作用的底物也比较复杂，同时不同来源的纤维素酶其组成及各组分的比例有较大的差异，致使纤维素酶活力的测定方法复杂而不统一。其中主要的检测方法有：棉线切断法， 滤纸崩溃法，羧甲基纤维素钠为底物的粘度减少和还原糖增加的测定法[2]，分光光度计法[3]，快速测定纤维素酶CMC液化活力法[4]，平板法，巴鲁阿-斯温( Bamch and swain) 测定法[5]。对于细菌等对纤维素分解能力强的微生物，由于对其酶的形成、分泌和作用机制研究较少，这些测定方法不一定适用。但目前对于这些方法测定的具体数值的可信度、可比性，却没有相关的报道研究。下面主要通过四种方法进行实验，研究这些实验方法的稳定性，从而为实验研究提供一定的参考依据[6]。2.1、材料与方法材料：主要仪器HH-6型恒温水浴锅；22PC型分光光度计；HG1001型电热鼓风干燥箱；FA2004型电子分析天平；UV-2401型紫外双光束分光光度计实验方法：2.1.1 试剂的配置：（1）PH4.6醋酸-醋酸钠缓冲液：11.8ml 冰醋酸定容至100ml，称取27,2g的醋酸钠溶解并定容至100ml将上述两种溶液等体积混合。（2）3,5-二硝基水杨酸溶液（DNS）：称取3,5-二硝基水杨酸6.3g于500ml大烧杯中，用少量蒸馏水溶解后加入2mol/ml NaOH溶液262ml，再加入到500ml含有185g酒石酸钾钠的热水溶液中，再加5g结晶酚和5g无水亚硫酸钠搅拌溶解，冷却后移入1000ml容量瓶中， 用蒸馏水定容至1000ml，贮于棕色瓶中，室温放置一周后使用。（3）CMC-Na溶液：称取0.625g 羧甲基纤维素钠，加热溶解，定容至100ml[7]。2.1.2 酶活测定方法葡萄糖标准曲线的绘制原理：3,5-二硝基水杨酸与还原糖共热后被还原成棕