最新实验原理与方法2009..doc

实验原理与方法 蔬菜生理与生态实验室 南京农业大学园艺学院 二零零九年十月 POD（过氧化物酶）活性的测定——愈创木酚法 3、CAT(过氧化氢酶)测定 4、抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性的测定 5、谷胧甘肽还原酶(GR)的活力测定: 6、O2-产生速率的测定(H2O2)含量的测定——碘化钾分光光度法 8、丙二醛（MDA）含量的测定 9、还原型抗坏血酸（ASA）和脱氢抗坏血酸（DHA）的测定 16、激素Indole-3-Acetic Acid（IAA）、Abscisic Acid（ABA）、GA3和ZA的测定 17、cDNA扩增片段长度多态性技术（cDNA-AFLP）TTC法）  一 氮蓝四唑（NBT）法测定超氧化物岐化酶（SOD） 【实验原理】 SOD是含金属辅基的酶。高等植物含有两种类型的SOD：Mn－SOD和Cu.Zn－SOD，它们都催化下列反应： 由于超氧自由基（O2.－）为不稳定自由基，寿命极短，测定SOD活性一般为间接方法。并利用各种呈色反应来测定SOD的活力。核黄素在有氧条件下能产生超氧自由基负离子O2.－，当加入NBT后，在光照条件下，与超氧自由基反应生成单甲月替 （ 黄 色 ） ，继而还原生成二甲月替 ，它是一种蓝色物质，在560nm波长下有最大吸收。当加入SOD时，可以使超氧自由基与H+结合生成H2O2和O2，从而抑制了NBT光还原的进行，使蓝色二甲 月替 生成速度减慢。通过在反应液中加入不同量的SOD酶液，光照一定时间后测定560nm波长下各液光密度值，抑制NBT光还原相对百分率与酶活性在一定范围内呈正比。反应液蓝色愈深，说明酶活性愈低。 【仪器、材料与试剂】 （一）仪器 1. 分光光度计 2. 台式离心机 （二）材料 1. 磷酸氢二钠 2. 磷酸二氢钠 3. 甲硫氨酸 4. EDTA-Na2 5. 核黄素 6. 氮蓝四唑(NBT) 7. 陶瓷小研钵 8. 4-5ml 离心管 9. 10ml 玻璃试管 （三）试剂 1. 0.05mol/L磷酸缓冲液(PBS，pH7.8)： A母液：0.2mol/L磷酸氢二钠溶液: 取Na2HPO4·12H2O（分子量358.14）71.7g； B母液：0.2mol/L磷酸二氢钠溶液：取NaH2PO4·2H2O（分子量156.01）31.2g。 分别用蒸馏水定容到1000ml。 0.05mol/L PBS（pH7.8））酶液提取上清夜即为SOD粗提液。 各管在560nm下的吸光度计算结果 已知SOD活性单位以抑制NBT光化还原的50％为一个酶活单位（U），按下式计算活性SOD总活性＝ [( Ack-AE )×V]/（1/2Ack×W×Vt） SOD比活力＝SOD总活性/蛋白质含量 SOD总活性以鲜重酶单位每克表示（u/g FW）；比活力单位以酶单位每毫克蛋白表示；Ack为照光对照管的吸光度；AE为样品管的吸光度；V为样品液总体积（ml）；Vt为测定时的酶液用量（ml）；W为样品鲜重（g）；蛋白质含量单位为mg/g。） Zhou W, Zhao D, Lin X. Effects of water logging on nitrogen accumulation and alleviation of waterlogging damage by application of nitrogen fertilizer and mixtalol in winter rape (Brassica napes L.). J. Plant Growth Regul, 1997,16, 47-53. 二 愈创木酚过氧化物酶（POD）活性的测定愈创木酚法 【实验原理】 在过氧化物酶催化下，H2O2将愈创木酚氧化成茶褐色产物。此产物在470nm处有最大光吸收，故可通过测470nm下吸光值变化测定过氧化物酶活性。 【仪器、材料与试剂】 （一）仪器 1. 分光光度计 2. 台式离心机 （二）材料 1. 磷酸氢二钠 2. 磷酸二氢钠 3. 2-甲氧基酚 4. 30％H2O2 5. 陶瓷小研钵 6. 2ml 离心管 （三）试剂 1. 0.2mol/L磷酸缓冲液(pH6.0)： A母液：0.2mol/L磷酸氢二钠溶液: 取Na2HPO4·12H2O（分子量358.14）71.7g； B母液：0.2mol/L磷酸二氢钠溶液：取NaH2PO4·2H2O（分子量156.01）31.2g。 分别用蒸馏水定容到1000ml。 0.2mol/L磷酸缓冲液(pH6.0)的配制：分别取A母液(Na2HPO4 )12.3ml和B母液(NaH2PO4 ) 87.7ml混匀即为100ml PBS(0