浅要猪链球菌9型钦州株的分离及其cps9H基因序列.docVIP

浅要猪链球菌9型钦州株的分离及其cps9H基因序列 摘要 对临床疑似猪链球菌9型(SS9)的病料进行实验室诊断。通过实验室检测结果证实,分离菌属于SS9,将其命名为QZ49;扩增其cps9H目的基因长为38bp;与GenBank上国内外SS9毒株核苷酸同源性介于97.%~99.%之间。 　　关键词猪链球菌9型;cps9H基因;分离;序列分析 　　 　　近年来,猪链球菌9型的流行趋势逐渐上升,在我国各省(市)均有不同程度的发生和流行[1-2],SS9已逐渐成为危害我国养猪业发展的疫病之一。本研究就钦州疑似SS9症状的病料进行细菌分离、PCR扩增,并进行测序分析,以期为SS9的分子流行病学提供数据支持。 　　1材料与方法 　　标准毒株及主要试剂 　　猪链球菌9型标准毒株(Y142株)由广西动物疫病预防控制中心实验室提供。dNTP、Taq酶、蛋白酶K、SDS、饱和酚等购自TaKaRa公司;LB培养基购自GIBCOL公司。 　　引物 　　根SS9荷兰5218株设计扩增cps9H基因引物:cps9H1:5′-GGCTACATATAATGGAAGCCC-3′;cps9H2:5′-CCGAAG TATCTGGGCTACTG-3′,预期扩增片段长约389bp。 　　细菌培养、纯培养及涂片镜检 　　采集某猪场疑似SS9型症状的病料接种鲜血琼脂培养基,3℃培养1h后观察。挑选可疑的单个菌落接种于链球菌增菌培养基中,3℃培养20 h收取细菌液体培养物,涂片、革兰氏染色镜检。 　　细菌的涂片镜检与DNA的抽提 　　取细菌纯培养物,涂片、革兰氏染色镜检。之后取液体培养物按传统DNA抽提方法抽提DNA,获得的DNA模板用于下一步操作。 　　基因扩增 　　取抽提的DNA模板进行cps9H基因的扩增,反应体系总体积2μL,内含模板 μL,加10×Reaction Buffer.μL,dNTP(/μL) μL,Taq DNA酶(U/μL)μL,MgCl2(2mmoL/L)1 μL,上下游引物(2pmoL/μL)各0.μL,加ddH2O补至2μL,置PCR仪中,9℃ 预变性min;9℃变性4s,5℃退火4s,7℃延伸60 s,30个循环;7℃延伸10 min。完毕后取PCR产物μL在10 g/L琼脂糖凝胶上电泳,置凝胶成像系统中观察结果。 　　基因序列分析 　　PCR阳性产物纯化后送宝生物工程(大连)有限公司测序。应用DNAStar软件将测序获得的SS9毒株cps9H基因序列截短并进行整理,与国内外已发表的SScps9H基因序列进行核苷酸同源性分析,建立系统发育树。 　　2结果与分析 　　细菌培养特征 　　该细菌在鲜血培养基上菌落呈针尖大小,圆形隆起,湿润透明,灰白色,为β-溶血;在血清肉汤中管底混浊呈沉淀状。革兰氏染色为G+菌。初步证实该分离菌属于猪链球菌9型。 　　扩增结果 　　扩增产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳,得到单一的约390 bp大小的目的片段(图1)。 　　测序结果及核苷酸同源性分析 　　通过测序,得到38bp核苷酸序列(图2)。用DNAStar软化进行同源性分析,QZ49株与荷兰5218株的同源性是%;与广西Y142、南京HA070725、湖北HB21都为%;与河南HN、湖北HB22分别为%和%;与广州GZ0565同源性最低,仅为%。 　　3结论与讨论 　　在猪链球菌35个血清型中,cps9H与其他34个血清型的序列同源性都很低,是国内外目前利用PCR技术鉴别诊断猪链球菌9型引物的主要基因组。SS9是继SS2型之后的主要流行血清型,主要流行于澳大利亚、德国、比利时和荷兰[3]。近些年来,在我国各省(市)也有关于SS9的报道[4-6],研究证实了SS9毒株确实已在钦州市的猪群中存在。序列分析结果显示,钦州分离株与国内外其他SS9毒株核苷酸同源性都较高。研究结果表明,钦州市现在流行的SS9毒株与国内外的流行毒株基本一致,没有发生太大的变异,预示在临床上重视控制SS2感染的同时,还应该加强防控SS9,以防在钦州市猪群中形成大规模的流行。 　　4参考文献 　　[1] 余炜烈,李春玲,王贵平,等.猪链球菌2型和9型广东分离株的病原特性[J].中国兽医科学,XX,37(8):650-654. 　　[2] 熊毅,刘棋,覃芳芸,等.猪链球菌亚种及1、2、9型四重PCR检测方法的建立[J].广西农业科学,XX,38(6):681-684. 　　[3] WISSELINK H J,SMITH H E,STOCKHOFE-ZURWIEDEN N,et al. Distribution of capsular types and production of muramidase-released prot