生化分析翻译作业-精.docVIP

2.1.1吸光光度法(280nm) 使用注意事项 吸光光度法操作起来十分快捷方便，因为并不需要添加额外的试剂或进行预处理。没有蛋白质标准需要准备。吸光光度法不消耗蛋白质，吸光度与蛋白质的浓度呈线性关系。由于不同的蛋白质和核酸俱有各自不同的吸收特性，因此对未知成分的物质或蛋白质的混合物，吸光光度法可能有较大误差。溶液中任何对紫外光有吸收的非蛋白成分都会干扰测定。细胞和组织样品中往往含有会干涉测定的不溶性或有色成分。吸光光度法最常见的用途是监视层析柱分数，或是应用在需要快速估测、蛋白质浓度的误差可以忽略不计的场合。吸光度法在操作时，常用牛血清白蛋白或其他纯蛋白质溶液进行标定。 原理 溶液中的蛋白质在280和200nm处对紫外光有最大吸收值。含芳环的氨基酸是造成280nm处吸收峰的主要原因，200nm处的吸收峰由肽键引起。二级、三级、四级结构都会影响吸收，所以pH、离子强度等，均可对吸收光谱产生影响。 仪器设备 除了标准溶液以外，还需要紫外分光光度计和石英比色皿。 分析 未知的蛋白质或蛋白质的混合物。使用下面的公式来粗略估算蛋白的浓度。 大多数分光计的光路长度为1cm。 浓度（mg/ml）=280nm处吸光度除以光路长度（cm.） 已知吸光系数的纯蛋白质。 对于1cm的光路，使用下列公式。 浓度的单位是采用mg/ml、%或体积摩尔浓度，取决于操作所使用的系数。 浓度=280nm处的吸光度除以吸光系数 可按下列关系式转换单位： Mg蛋白/ml=％蛋白除以10=质量除以蛋白质分子的摩尔浓度 可能遭核酸污染的未知样品。使用下列公式来估算蛋白质浓度： 浓度（mg/ml）=（1.55x280nm处吸光度）-（0.76x260nm处吸光度） 注意事项 冷溶液会使试管起雾，热溶液会释放气泡，从而干扰读数。对于浓缩溶液（吸光度大于2）可简单地对其进行稀释。 常用蛋白质标准液的吸光系数： 牛血清白蛋白（BSA）：63 牛，人，或兔IgG：138 鸡卵清蛋白：70 参考文献 Layne,E.SpectrophotometricandTurbidimetricMethodsforMeasuringProteins.MethodsinEnzymology3:447-455.1957. Stoscheck,CM.QuantitationofProtein.MethodsinEnzymology182:50-69.1990. 吸光度测定（205nm） 使用注意事项 参见波长在280nm处吸光度测定的注意事项。此方法与测定280nm处的吸收一样方便。因为核酸在205nm处的吸收非常小，如果样品被核酸过度污染，这种方法可能是首选的测量方法。设置波长有点棘手，因为205nm正好处于蛋白质吸收峰的肩部。 原理 见280nm处吸光度测量的讨论。 步骤 含0.01％十二烷基聚乙二醇醚的缓冲液，以防蛋白质在塑料或玻璃表面的吸附。对于在205nm处的检测这是必要，因为稀溶液的损失更高。 紫外灯预热（约15分钟）。 调整波长为205nm 只用缓冲溶液校准吸光度至零 测量蛋白质溶液吸光度 分析 蛋白质浓度（mg/ml）=31（在205nm处的吸收）。 注意 冷溶液会使试管起雾，热溶液会释放气泡，从而干扰读数。溶液必须比280NM处吸光度检测中使用的更稀。205nm处蛋白质的吸光更为强烈，根据推测也有更少的蛋白质间的变异。除了需要设置一个准确的波长，杂散光也是一大问题。为了避免这些问题，使用10微克/微升牛血清白蛋白作为标准溶液。设定缓冲溶液吸光度为零，通过内插法确定未知样品的浓度（浓度在0至10微克/微升之间）。因为在0至10微克/微升区间内，吸光度和浓度呈线性关系。 通过确定210nm处（消光系数的范围从20到24）的吸光度，需要准确设置波长的难题可以避免。但是，这在缓冲体系中反应不敏感，也更多变。 参考文献 Scopes,RK.Scopes,RK.AnalyticalBiochemistry59:277.1974. Stoscheck,CM.QuantitationofProtein.MethodsinEnzymology182:50-69.1990. 未知浓度蛋白质消光系数的测定 使用注意事项 适用于可用于未知消光系数的纯蛋白质溶液。 仪器设备 除了标准溶液以外，紫外分光光度计和石英比色皿都是必需的。 步骤 将溶液稀释30倍在205nm处检测，配置含0.01％十二烷基聚乙二醇醚的缓冲液，以防蛋白质在塑料或玻璃表面的吸附。 分析 使用下面的公式确定205nm处的消光系数： E（205nm）=27+120×（280nm处吸光度除以205nm处吸光度） 在205nm的读数必须乘以使用公式前的稀释倍数。 接下来，确定蛋