猪肺炎支原体生长培养基的筛选-精.docVIP

猪肺炎支原体生长培养基的筛选 李石，李劼*周霞* (新疆石河子大学动物科技学院，石河子市　832003) The screening of Mycoplasma hyopneumoniae growth medium Li Shi,Li Jie*,Zhou Xia* (College of animal science and technology of shihezi university,Shihezi 832003,China) Abstract: In order to develop the culture characteristics of Mycoplasma hyopneumoniae, pick out the most suitable medium, the color change unit (CCU) method and PCR method was used to test and compare the culture of swine mycoplasmal pneumonia cell number between four kinds of medium and improved KM2 medium. The results showed that: the improved KM2 medium was the optimum medium, the color change unit is 108CCU/ml after 10 days of culture. Key words: Mycoplasma hyopneymoniae; medium; screening 猪肺炎支原体（Mycoplasma hyopneymoniae,Mhp）是引起猪支原体肺炎（MPS，又称“喘气病”）的病原。[1], 常因猪鼻支原体的过度生长而被掩盖[2]。本实验将猪肺炎支原体强毒济南株分别接种于Goodwin等复合培养基、驴血清培养基、A26培养基、KM2培养基以及改良KM2培养基中进行了培养试验，CCU)计数法和PCR方法对猪肺炎支原体在5种培养基中的生长繁殖比较，以期筛选出Mhp生长适培养基，为快速、有效地诊断猪支原体肺炎提供参考依据。 1材料及方法 1.1材料 1.1.1实验菌株 猪肺炎支原体株。猪肺炎支原体 1.1.2培养基 Goodwin等氏复合培养基(简称GW培养基)、A26肉汤培养基(简称A26培养基)和驴血清培养基参考文献[]配制KM2培养基购于江苏农科院兽医所改良KM2培养基由本实验室自己配制s液400mL；DMEM400mL；无菌猪血清200mL；酵母浸液10mL；青霉素200IU/mL；酚红4g/L；pH调至7.6）。 1.1.3试剂及仪器 10×Buffer、25 mmol/L MgCl2、2.5 mmol/L dNTPs、2.5UTaq酶(北京诺维森生物科技有限公司)；Marker1、Loding Buffer(广东东盛生物科技有限公司)；PCR仪（TC-512)，电泳仪等。 1.2方法 1.2.1菌株复苏将冻存用mL灭菌水稀释，分别接入到5种液体培养基中进行菌株复苏培养，传2～3代。 1.2.2颜色改变单位(CCU) 将种培养基分别分装于无菌试管中，每管2.7m，于第一管加入菌液0.3m，混匀后吸取0.3m至第二管，做10倍稀释10-8，0.3mL废弃，设各液体培养基做空白对照每种培养基两。于37℃恒温箱培养，每天观察各培养基的颜色变化，CCU。? 1.2.3 PCR方法参考文献[]合成1对Mhp ldh 引物，上游引物p1为：5′-CCGTTGAAGCCTTGCTGTAT-3′，下游引物p2为：5′-CGGTTAGTGTCTCCCGTTATG-3’，扩增片段大小为287bp。引物由上海生工生物工程有限公司合成。 模板提取：取各最后一管有颜色变化的培养基1mL，14000rpm离心10min，弃上清，沉淀用1mL无菌TE缓冲液洗涤1～3次，之后用60～100μL TE悬浮，于沸水浴10 min，置冰上冷却后，10000 r/min 离心10 min，取上清作为模板 PCR体系（25μL）：10×Buffer 3μL，10mM dNTPs 0.6μL，上下引物各1μL，模板4μL，Taq酶0.3μL，补ddH2O至25μL。设定以下参数进行PCR反应：94℃预变性3min，94℃变性30S，54.6℃退火30S，72℃延伸40S，进行30个循环，72℃再延伸10min，4℃保存。取PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳。2结果与分析 2.1CCU计数结果 各CCU结果 Table 1：The results of CCU in different medium af