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生科大实验 酵母蔗糖酶的提取纯化与鉴定 班别：生物科学201102班 组员：陈渭鸿 陈景富 学号： 实验时间： 实验指导老师： 开题报告：酵母蔗糖酶的提取纯化与鉴定 一．实验目的： 蔗糖酶（E.C.3.2.1.26）（?—D—呋喃果糖苷果糖水解酶），能催化非还原性双糖（蔗糖）的1，2-糖苷键裂解，释放出等量的果糖和葡萄糖。不仅能催化蔗糖水解生成葡萄糖和果糖，也能催化棉子糖水解，生成密二糖和果糖。 由于果糖甜度高 ,约为蔗糖1.36～1.60倍 ,在工业上具有较高的经济价值。可用以转化蔗糖,增加甜味,制造人造蜂蜜,防止高浓度糖浆中的蔗糖析出,制造含果糖和巧克力的软心糖,还可为果葡糖浆的工业化生产提供新的方法。 二．实验原理 蔗糖酶以两种形式存在于酵母细胞膜的外侧和内侧，在细胞膜外细胞壁中的称之为外蔗糖酶,其活力占蔗糖酶活力的大部分，是含有50% 糖成分的糖蛋白。在细胞膜内侧细胞质中的称之为内蔗糖酶，含有少量的糖。两种酶的蛋白质部分均为双亚基，二聚体，两种形式的酶的氨基酸组成不同，外酶每个亚基比内酶多两个氨基酸，Ser和Met，它们的分子量也不同，外酶约为27万(或22万，与酵母的来源有关)，内酶约为13.5万。尽管这两种酶在组成上有较大的差别，但其底物专一性和动力学性质仍十分相似，因此，本实验未区分内酶与外酶，而且由于内酶含量很少，极难提取，本实验提取纯化的主要是外酶。 每摩尔蔗糖水解产生两摩尔还原糖，蔗糖的裂解速率可以通过NeLson法测定还原糖的产生数量来测定。一个酶活力单位规定为在标准分析条件下每分钟催化底物转化的数量。比活力单位为每毫克蛋白含有酶活力单位。 三．实验内容： （一 ） 酵母细胞破碎与蔗糖酶提取条件的选择 （二 ) 蔗糖酶的盐析曲线的制作与沉淀分离 (三 ) 蔗糖酶的有机溶剂沉淀曲线的制作与沉淀分离 (四 ) 蔗糖酶的DEAE-纤维素柱层析纯化 (五 ) 蔗糖酶的Sephadex G-150柱层析纯化 (六 ) 蔗糖酶溶液的冷冻干燥 (七 ) 蔗糖酶的纯度分析：聚丙烯酰胺凝胶电泳 (八 ) 蔗糖酶的理化性质研究 四、实验设计与研究 1 器材与方法 1.1主要单元操作技术与设备 1.1.2单元操作技术 细胞组织破碎术、离心分离技术、双水相萃取技术、离子交换层析技术、凝胶层析技术、超滤技术、冷冻干燥技术、分光光度技术、电泳技术等生物分离与检测技术； 1.1.2主要设备 烘箱、恒温摇床、真空干燥箱、分析天平、电子台秤、超声波细胞破碎仪、粉碎机、超滤器（500ml～5000ml）、冷冻离心机（8000-10000 r/min，50ml×6；250ml×6）、普通离心机（5000 r/min，200ml×4）、台式离心机（16000 r/min,5ml×6）冷冻干燥机、-80度冰箱、制冰机、酸度计、电热恒温水浴锅、匀浆机、蛋白质色谱分离系统（核酸蛋白检测仪、部分收集器、蠕动泵、梯度混合器、φ10-25mm,h300-700mm层析柱）电泳仪及垂直板电泳槽、脱色摇床、紫外-可见光分光光度计、荧光分光光度计、高效液相色谱、气相色谱、凝胶成像系统、250ml和500ml旋转蒸发仪、微量凯氏定氮仪、常量凯氏定氮仪、500-1000W电炉、超声波清洗器、振动混合器、移夜枪（200-5000ul）、层析缸、电吹风等。 1. 2 实验材料与试剂 1.2.1酵母菌的扩大培养：采用采用实验室经过筛选诱变获得的酵母菌, 增殖培养基：葡萄糖5.0g/L、蛋白胨0.5g/L、酵母膏0.5g/L、七水硫酸镁0.1g/L 和磷酸二氢钾0.1g/L，调节pH 为5.0。 发酵培养基：葡萄糖12％～15％、蛋白胨0.5g/L、酵母膏0.5g/L，七水硫酸镁0.1g/L、磷酸二氢钾0.1g/L 和硫酸铵0.5g/L，调节pH为5.0。 1.2.2实验试剂 甲苯（使用前预冷到0℃以下）；95%乙醇；DEAE-纤维素；Sephadex G-150；0.05mol/L Tris-HCl缓冲液，pH7.3 ；十二烷基硫酸钠(SDS);其余试剂均为国产分析纯。 1. 2 分析方法 1.2.1蛋白质浓度的测定： 采用Folin法（试剂方法参考生物化学原理和方法）。 1.2.2还原糖的测定： 采用DNS法（试剂方法参考生物化学原理和方法）。 1.2.3酶活性测定（参考：徐桦,陆珊华,孙爱民.酵母蔗糖酶Km值的测定