遗传病的诊断2__培训课件.pptVIP

方法：B超、腰穿针穿刺、穿过腹壁和子宫壁进 入羊膜腔。 20-30ml。 应用：1、生活的脱落细胞。-- 染色体分析、酶和蛋白质检 测、性染色质检查、提取DNA作基因分析 2、羊水：AFP、乙酰胆碱脂酶。 1 2 3 4 CHE ACHE 1、2正常 3、4患者 　　5．绒毛吸取：绒毛取样（chorionic villi aspiration sampling,cvs） 方法：绒毛可经宫颈部取样，最好在B超监视下进行。绒毛枝经处理（与蜕膜严格分离）或经短期培养。 时间：一般于妊娠8--10周时进行。 范围：染色体分析、酶和蛋白质检测和直接抽取DNA进行基因分析。 优点：时间早。 6．脐带穿刺术（cordocentesis）： 经母腹抽取胎儿静脉血，可在B超引导下于孕中期、孕晚期（17-32周）进行。脐血可作染色体或血液学各种检查，亦可用于因羊水细胞培养失败，DNA分析无法诊断而能用胎儿血浆或血细胞进行生化检测的疾病，或在错过绒毛和羊水取样时机下进行，在一些情况下，可代替基因分析。 胎儿的表型形态特征、分析蛋白质和酶的正常与否、检查染色体核型、鉴定基因。 进行基因检测有两个必要条件： 一、是必需的特异的DNA探针； 二、是必需的基因组DNA。 当两者都变性呈单链状态时，就能进行分子杂交。 基因探针的定义： 基因探针（probe）就是一段与目的基因或DNA互补的特异核苷酸序列。它可以包括整个基因，也可以仅仅是基因的一部分；可以是DNA本身，也可以是由之转录而来的RNA。 1、来自基因组中有关的基因本身，称为基因组探针（genomic probe）。 2、是从相应的基因转录获得了mRNA，再通过逆转录得到的探针，称为cDNA 探针（cDNA probe）。与基因组探针不同的是，cDNA探针不含有内含子序列。 3、可在体外人工合成碱基数不多的与基因序列互补的DNA片段，称为寡核苷酸探针。长约20个bp左右。 探针的来源： 探针的标记：放射性同位素标记（32P、35S）、地辛高、辣根过氧化物酶、生物素。 方法：缺口平移、六核苷酸引物标记法。 基因探针的标记： 一、分子杂交 1. Southern印迹杂交 第六节 基因诊断 一、分子杂交 1. Southern印迹杂交 第六节 基因诊断 2. ASO杂交 1、Southern 杂交法 细胞 提取目的基因 限制性内切酶消化 琼脂糖凝胶电泳 观察分析 变性原位转移硝酸纤维滤膜上 探针杂交 放射自显影 Southern印迹杂交 - + 一、分子杂交 1. Southern印迹杂交 第六节 基因诊断 2. ASO杂交 二、聚合酶链式反应 聚合酶链反应：（polymerase chain reaction,PCR） 原理：1）引物的设计：合成2个与目的DNA序列两侧 互补的寡核苷酸，一般长约15-25bp。 2）基本条件：引物、DNA前提物质、含有一 定离子（Mg）的反应体系 、DNA聚合酶、 模板。 3）三段循环：变性：93-95；复性：50-70 延伸：70-75。n个周期，2n个DNA 聚合酶链反应 （polymerase chain reaction,PCR） PCR原理 PCR原理 １变性 PCR原理 １复性 PCR原理 １延伸 PCR原理 ２变性 PCR原理 ２复性 PCR原理 ２延伸 PCR原理 ３变性 PCR原理 ３复性 PCR原理 ３延伸 预变性(93-95?C,2-5m) 变性(93-95?C,30s) 复性 (50-70?C,30s) 延伸(75?C,30-60s) 总延伸(75?C,7m) (25-35) PCR的一般过程： 经过30次的循环, 扩增的DNA片段可达100万倍以上。 直接分析法 ?A?A ?A?S ?S?S MstⅡ： CCTNAGG 1.2 Kb 0.2Kb 1.40 Kb 1.20 Kb 0.20 Kb 镰状细胞贫血(HbS)： 第5～7位密码子 ?A：