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现代生物技术复习资料 PCR技术 PCR聚合酶链式反应（英文全称：Polymerase Chain Reaction）， 简称PCR。聚合酶链式反应(PCR)是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法,由高温变性、低温退火（复性）及适温延伸等几步反应组成一个周期,循环进行,使目的DNA得以迅速扩增,具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。它不仅可用于基因分离、克隆和核酸序列分析等基础研究,还可用于疾病的诊断或任何有DNA,RNA的地方．聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，简称PCR）又称无细胞分子克隆或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增技术。PCR反应体系 Buffer 缓冲液 dNTP 原料 Primer 引物 DNA分子 模板 Taq酶 DNA聚合酶 H2O 去离子水 总体积 20-100 ml 循环参数 1 变性 使双链DNA解链为单链 94oC 20-30秒 2 退火 温度由引物长度和GC含量决定。 增加温度能减少引物与模板的非特异性结合;降低温度可增加反应的灵敏性。因此，退火温度要合适。 3 延伸 70-75℃,一般为72℃ 延伸时间由扩增片段长度决定 4 循环次数 主要取决于模版DNA的浓度 一般为25-35次 次数过多：扩增效率降低，错误掺入率增加 经典循环参数 94℃ 5min 94℃ 30s 55℃ 45s 72℃ 1min 72℃ 7min 4℃ forever 引物设计： （1）序列应位于高度保守区,与非扩增区无同源序列。 （2）引物长度以15-40 bp为宜。 （3）碱基尽可能随机分布,G+C占50-60%，尽量避免数个嘌呤或嘧啶的连续排列。 （4）引物不应当设计在靶DNA的二级结构区域，引物内部也要避免形成二级结构。 （5）两引物间避免有互补序列。 （6）引物3’端为关键碱基；5’端无严格限制。 （7）人工合成引物最好通过PAGE或HPLC纯化。 常用PCR技术 一，目的DNA片段的克隆； 二，反转录PCR得到cDNA; 三，菌落和菌液PCR； 四，半定量RT-PCR; 五，荧光实时定量qRT-PCR; 六，Tail-PCR(thermal asymmetric interlaced PCR ); 七，引入定点突变PCR. DNA重组技术(基因克隆，分子克隆) 步骤： 1，提取目的基因，酶解连接到克隆载体； 2，将重组DNA分子转入受体细胞中复制保存； 3，筛选和鉴定转入了重组DNA的受体细胞； 4，检测含重组DNA的受体细胞中外援基因的表达。 限制性内切酶:一种在特殊核甘酸序列处水解双链DNA的内切酶。 Ⅰ型限制性内切酶既能催化宿主DNA的甲基化，又催化非甲基化的DNA的水解； Ⅱ型限制性内切酶只催化非甲基化的DNA的水解。 最早发现的Ⅱ型限制性内切酶 EcoR1。 大多数Ⅱ型限制性内切酶 的识别序列是回文序列。 限制性内切酶的命名 第一个字母为含有此酶的细菌属名的第一个字母；后两个字母为种名的前两个字母，小写； 然后是株系，用大写字母，通常省略； 罗马数字表示从同一细菌中分离的不同的限制性内切酶。 EcoRⅠ EcoRⅤ BamHⅠ XbaⅠ BglⅡ DNA连接酶 大多数连接酶都是从T4噬菌体中分离出来的；催化在两条DNA链的末端形成磷酸二酯键。 克隆载体 可携带插入的目的DNA进入宿主细胞内并能自我复制的DNA分子。此种DNA分子含有能在宿主中复制的位点和便于筛选的遗传标志。 通常采用从病毒、质粒或高等生物细胞中获取的DNA作为克隆载体，在载体上插入合适大小的外源DNA片段，并注意不能破坏载体的自我复制性质。将重组后的载体引入到宿主细胞中，并在宿主细胞中大量繁殖。常见的载体有质粒，噬菌粒，酵母人工染色体。 对载体的要求： ①能在宿主细胞中复制繁殖，而且最好要有较高的自主复制能力。 ②容易进入宿主细胞，而且进入效率越高越好。 ③容易插入外来核酸片段，插入后不影响其进入宿主细胞和在细胞