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一种新型的基因开关─RU486诱导调控系统 随着基因治疗研究的不断深入，目的基因的精确表达已经成为首要问题。由于解决上述问题最好的方法就是拥有一系列复杂严密的基因调控系统，所以研究者们一直在寻求一种高效可靠的诱导调控体系，而RU486诱导调控系统就是目前找到的较好的一种。近十年来这一系统的研究已很广泛，它的结构也有几次大的改进，现就此予以综述。 一 RU486调控系统的结构 1 RU486调控系统的基本结构 RU486调控系统是1994年被Wang等[1]提出的，它由嵌合调控子反式作用调控区和目的基因区两部分组成。反式作用调控区含有任意启动子控制下的嵌合调控子（chimeric regulator, GLVP），后者是一种嵌合型的可诱导转录因子，它包括酵母转录因子Gal4的DNA结合区（Gal4DBD）、单纯疱疹病毒蛋白VP16激活区（VP16AD）和PR-891突变体改良后的C末端配体结合区（PRLBD-891）三部分。目的基因区是指在最小启动子（TATA盒或胸腺嘧啶脱氧核苷激酶启动子tk）和四个Gal4 DNA结合区串联体（p17times;4）调控下的目的基因，如图1。 nbsp; 在GLVP中，Gal4DBD 代替了孕酮受体的DNA结合区，从而避免了任何激活内源性孕酮敏感性基因的可能，并且由于GAL4 DBD在哺乳动物细胞中不存在，目前也没有发现任何哺乳动物的靶基因可以被Gal4激活，所以这一调控子只会调控目的基因的表达，而不会影响任何内源基因[1]。PR-891是指野生型孕酮受体在891位点平头切断造成的突变体，因此其不能与孕酮受体激活剂R5020结合，但却可以与抗孕酮片RU486结合，从而在RU486存在时激活孕酮受体介导的基因。这可能是由于PR-891比野生型受体少42个氨基酸，而孕酮结合位点属于缺失的下游内，RU486结合区则位于上游位置[2]。这就避免了给予RU486时，激活内源性孕酮受体诱导其它基因引起一系列的细胞反应。并且由于反式作用调控子是一种嵌合型的可诱导转录因子，所以它不再与孕酮反应元件（PREs）或糖皮质类固醇应答成分（GREs）结合[3]，干预孕酮受体介导的转录，取而代之的是在RU486作用下，这一调控子仅仅与目的基因区的Gal4DBD结合，并激活目的基因转录表达[2]。由于PRLBD-891的转活能力较差，而VP16AD，即VP16的 C末端为酸性，可以直接与转录起始复合物中的转录因子TFIIB、TATA结合蛋白（TBP）和TBP辅助因子TAFII40相互作用，具有很强的转活功能。 在目的基因区内，启动子有两种：胸腺嘧啶脱氧核苷激酶启动子（tk）和腺病毒E1b基因中仅仅包含TATA盒的最小启动子。Tsai[2]等使用氯霉素乙酰转移酶（CAT）作报告基因对二者进行比较发现，p17x4-TATA-CAT比p17x4-tk-CAT转染时CAT基础活力明显要低一些；而给予RU486后，前者的CAT效能可达大约50倍，后者仅有10~15倍。这可能是由于tk启动子中含有GC和CAAT盒等序列，从而使转录效能较大。所以TATA盒启动子结构应用于要求目的基因的基础表达很低时，而在基础活力稍高能够耐受，要求转录效能很大时应使用tk启动子结构。对于p17x4，Gal4 DNA结合区的四个串联体则在这一系统中可以提供最大的转录效能。 2 RU486调控系统的结构改进 为了使RU486调控系统将来能够应用于人类的基因治疗，降低细胞毒性和免疫原性，Mark等[4]1999年使用NFkappa;B家族成员――人的p65激活区（286~550）替代VP16激活区，构建出新的RU486反式作用调控区（GLP65），以减少VP16激活区可能带来的免疫反应。他们发现使用TATA盒启动子启动目的基因时，在没有RU486的情况下，GLP65的基础活力明显低于GLVP；给予RU486后两个调控子均表现出配体剂量依赖性的目的基因表达，这时GLVP组目的基因的表达更多，不过由于GLP65的基础值很低，所以RU486给予时，目的基因的表达倍数会更高。tk做目的基因启动子时，上述两种RU486系统则不管是否给予配体，两者的作用相当。所以在使用GLP65时，最好选用TATA盒启动子作为目的基因的启动子。 另外，Mark等[4]在反式调控区与目的基因区之间插入小鸡beta;-球蛋白5rsquo;端区域作为绝缘子（INS）将二者分隔，使目的基因在没有RU486的情况下不受调控系统的调节而产生表达。但是他们发现在活体大鼠模型，没有RU486表达，有无绝缘子都不会有目的基因的表达；但是HELA细胞水平上，不含绝缘子者的目的基因则会有较少的表达，而含绝缘子者没有。 二 RU486调控系统