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乌司他丁对急性肺损伤组织中水通道蛋白表达的研究 　　　作者：郭亮 张端莲 吴惠芬　 蔡丽华 【摘要】nbsp; 目的:探讨乌司他丁对急性肺损伤组织中水通道蛋白-1、4（Aquaporin，AQP-1、4）的表达及临床意义。方法: 应用脂多糖（LPS）诱导大鼠急性肺损伤（ALI）模型，然后应用乌司他丁进行干预。实验设对照组、模型组、乌司他丁组，采用免疫组化染色， 检测乌司他丁（ulinastatin，UTI） 对急性肺损伤大鼠肺组织中水通道蛋白-1、4（AQP-1、5）的表达， 利用HPIAS-2000图像分析系统测定水通道蛋白-1、4在以上各组中表达的平均光密度和平均阳性面积率。结果: 实验对照组肺组织表达高水平AQP-1、4;模型组肺组织呈浅黄色染色， AQP-1、4表达较低;乌司他丁组肺组织表达高水平AQP-1、4。经 q 检验，实验对照组与模型组之间，AQP-1、4的平均光密度及阳性面积率有显著性差异（ P lt;0.01）;实验对照组与乌司他丁组之间，AQP-1、4的平均光密度及阳性面积率差异无显著性（ P gt;0.05）。结论:乌司他丁能使急性肺损伤组织中AQP-1、4呈高表达，对急性肺损伤组织有重要的保护作用。 【关键词】nbsp; 乌司他丁; 急性肺损伤; 水通道蛋白-1、4 ; 大鼠 　　急性肺损伤（ALI）是以通透性肺水肿为特征的一种临床综合征，其严重阶段即急性呼吸窘迫综合征（ARDS）。虽然对其发病机制已进行了大量的研究［1］，发现多种炎性介质和多种细胞参与发病，但发病机制仍不十分清楚，因此给临床治疗带来诸多问题。乌司他丁是从男性尿中分离纯化的尿胰蛋白酶抑制剂，为糖蛋白，乌司他丁分解形成的低分子量成分也具有很强的抑制水解酶的作用，除对多种蛋白酶、糖和脂水解酶有抑制作用外，还能抑制心肌抑制因子产生，改善休克时的循环状态，对溶酶体膜有稳定作用，有抑制炎症介质的释放等功能［2］。并且有实验报道［3］，乌司他丁在减轻肺损伤、缓解成人呼吸窘迫症病人呼衰等方面都起着重要作用。急性肺损伤（acute lung injury，ALI）时中性粒细胞在肺内聚集以及血管内皮细胞的功能受损，释放多种炎症介质及氧自由基、蛋白酶。近来，有许多文献报道［4］，乌司他丁为一种高效广谱的水解酶抑制剂，能抑制炎症介质的产生及氧自由基的释放，在临床上已广泛应用于DIC、休克、急性胰腺炎等炎性疾病的治疗，但有关乌司他丁对急性肺损伤炎性细胞因子影响的研究尚少。我们应用脂多糖（LPS）诱导大鼠急性肺损伤（ALI）模型，然后应用乌司他丁进行干预，观察急性肺损伤大鼠肺组织中水通道蛋白（AQP）的表达， 利用HPIAS-2000图像分析系统测定水通道蛋白在以上各组中表达的平均光密度和平均阳性面积率，进一步探讨乌司他丁在治疗急性肺损伤中的作用机制。 　　1材料和方法 　　1.1动物模型制备及分组 健康Wistar大鼠60只（雌雄不拘）， 清洁级。平均体重（180±35）g，由武汉大学实验动物中心提供。试验前禁食12h， 自由饮水。实验分组分为3组:实验设对照组（注射等量生理盐水， n =20）、模型组（经颈外静脉缓慢注射LPS 2.5 mg/kg， n =20）及乌司他丁组（于注射LPS前1h，腹腔注射乌司他丁100 000 U/kg， n =20）。称重后， 7%水合氯醛5ml/kg 腹腔注射麻醉， 仰卧固定， 模型组消毒后经颈外静脉缓慢注射LPS 2.5 mg/kg，乌司他丁组于注射LPS前1h，腹腔注射乌司他丁100 000 U/kg。 　　1.2动物标本制备将各组动物处死，收集肺组织标本，进行组织学及免疫组织化学标本制作，取材时间为LPS注射后4h（T4）。主要试剂 :① 浓缩型兔抗鼠AQP1及AQP4多克隆抗体（武汉博士德生物技术公司）;② 超敏即用型S-P通用型免疫组织化学试剂盒（福州迈新生物有限公司）;③ 显色试盒及多聚赖氨酸（北京中山生物技术有限公司）。主要仪器: YWY781型医用微波仪（250 W，50 Hz），浙江临安电子器材厂生产;家用高压锅。 　　1.3方法 　　1.3.1常规HE染色 取材、固定、脱水、透明、切片和HE染色。 　　1.3.2免疫组织化学S-P法检测AQP1及AQP5相关抗原主要步骤如下:① 组织切片5μm，常规脱蜡至水，蒸馏水洗;② 3%过氧化氢，37℃孵育10 min以抑制内源性过氧化物酶活性，PBS洗4×5min;③ AQP1及AQP4采用微波抗原修复（3档，10 min），采用高压抗原修复PBS洗4×5min;④ 正常羊血清37℃孵育10 min以减少非特异性反应;⑤ 一抗（AQP1，1:100;AQP4，1:100）3