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免疫注射法建立家兔ROU模型 　　摘要：目的 利用实验性家兔口腔黏膜组织匀浆加完全弗氏佐剂注射方法，免疫法建立复发性口腔溃疡动物模型，为研究人类ROU的发病机制及治疗提供理论基础。方法 应用从实验性家兔提取的口腔黏膜组织匀浆加完全弗氏佐剂，作为抗原免疫家兔。在家兔脊柱两侧皮内注射上述制备抗原，每2w注射一次，共12w，定期观察家兔口腔黏膜变化及溃疡发病情况记录溃疡大小及愈合情况，切取口腔黏膜溃疡区的组织病理切片进行观察，检测血清中抗口腔黏膜抗体滴度验证模型建立是否成功。结果 与空白组相比，以口腔黏膜组织匀浆+完全弗氏佐剂作为抗原的实验组家兔都均出现ROU，溃疡表面连续性破坏且有假膜覆盖，上皮内有密集的淋巴细胞、单核细胞浸润，固有层炎症细胞大量浸润，血清中均出现抗口腔黏膜抗体阳性。结论 利用家兔口腔黏膜组织均浆作为抗原，可引起实验性家兔发生ROU，其临床表现及组织学检查均与人类ROU相似。 　　关键词：家兔；口腔溃疡模型；免疫 　　人类各种疾病的发生发展十分复杂，而动物模型的建立为深入探讨疾病的发病机理及疗效机理提供基础。复发性口腔溃疡（recurrent oral ulcer，ROU）又称为复发性阿弗他溃疡（recurrent aphthous ulcer，RAU）、复发性阿弗他口炎（re-current aphthous stomatitis，RAS），是一类慢性口腔黏膜炎症性疾病[1]。流行病学调查显示，其发病率高达20%左右，具有周期性、复发性及自限性等特点[2-3]。 　　有学者发现，用免疫荧光法研究显示ROU基底膜荧光效应及血循环中存在抗口腔黏膜抗体，说明免疫因素是ROU发病的可能因素之一[2]。由此致病机制，通过免疫因素成功建立实验动物ROU模型具有重要意义，为深入探讨ROU的发生发展提供研究基础。 　　1 实验动物及方法 　　1.1实验动物 新西兰家兔40只，雄性，体重（2±0.2）kg，由山西医科大学动物实验中心提供，饲养于山西医科大学动物实验中心。家兔基础饲料：山西医科大学动物实验中心提供。 　　1.2方法 　　1.2.1动物分组 新西兰家兔30只，雄性，体重（2±0.2）kg，由山西医科大学动物实验中心提供。单笼，颗粒饲料饲养，150g/只/d，自由饮水，室温（20±2）℃，相对平均湿度45%，实验室适应性喂养1w。其中10只急性猝死取口腔黏膜组织备用，其余20只家兔按随机数字表随机分为两组，分别为空白对照组（10只）、实验组（10只）。 　　1.2.2动物模型建立 　　1.2.2.1抗原制备 15只家兔采用空气栓塞法急性处死，无菌条件下，口腔黏膜下注射生理盐水，剥取家兔口腔黏膜组织，用生理盐水冲洗干净，玻璃匀浆器匀浆，并加入磷酸盐缓释液，超声波震荡后将组织研磨液转移分装至1.5ml的离心管中，于4℃离心（14000rpm，10min），去沉淀物，将匀浆液置于-70℃低温冰箱备用。免疫注射前，匀浆液中加入等量（等体积）费氏佐剂，振荡器将二者充分混匀，呈乳状液（放置不分层或者滴一滴于水面，仍保持为滴状不散开）。 　　1.2.2.2动物模型建立 实验组30只家兔3%戊巴比妥于家兔耳缘静脉麻醉，取俯卧位，固定家兔四肢和头部于手术架，背部剃毛并常规消毒，将抗原乳状液注射于家兔脊柱两侧皮内，每次注射4点，每点1ml，1次/2w×6次。实验组家兔口腔黏膜于第三次注射结束后开始出现不同程度充血。8w后陆续出现溃疡，多集中于上唇、双颊粘膜，溃疡面红肿，形态不规则，部分病损面表面可见黄白色伪膜，触之疼痛反应明显。 　　1.2.2.3组织病理学检查 建模12w结束后，按随机数字法，处死空白对照组、实验组家兔各一只，3%戊巴比妥于家兔耳缘静脉麻醉，取仰卧位，固定家兔四肢和头部于手术架，切取对照组家兔口腔黏膜组织和实验组家兔口腔溃疡黏膜组织，切取组织体积大小均为5mm×5mm×2mm。无菌生理盐水冲洗后，10%甲醛固定液固定48h，常规石蜡包埋，以8μm厚度进行黏膜组织横断面切片，进行HE染色，显微镜下观察口腔黏膜的组织变化。 　　1.2.2.4血清中抗口腔黏膜抗体检测 在实验前，第三次注射抗原后10d及结束观察前，从实验组及对照组家兔耳缘静脉各采血4ml，采用补体结合试验，以口腔黏膜匀浆作抗原，检测血清中抗口腔黏膜抗体。 　　2 结果 　　2.1对照组家兔口腔黏膜未见明显变化，活动正常，反应灵活，饮食正常，毛色浓密光亮。实验组家兔口腔黏膜于第三次注射结束口腔黏膜出现不同程度充血，口唇处可见潮湿流涎，8w后陆续出现溃疡，多集中于上唇、双颊粘膜，溃疡面红肿，形态不规则，表面可见黄白色伪膜，触之疼痛反应明显；家兔活动量减少，反应迟缓，饮食饮水量减少。 　　2.2组织病理学检查HE染色后，对照组黏