蛋白表达概述幻灯片.pptVIP

* 例3:表达条件对表达的影响 pET21,BL21(DE3)-RIL,表达的蛋白:His6-REIIBP(MW67KD) 0.1mM IPTG,incubate for 16h at 16℃ 0.1mM IPTG,incubate for 3h at 37℃ N I S P N I S P U:Uninduced crude extract I:Crude extract after induced S:Lysis supertanant P:Lysis precipitation 总结 任何一个达到特定目标的表达可以在Vector，Strain和Growth Condition三个水平进行调控； 许多时候为了达到高产量，高活性，易于下游纯化，在这三个水平上进行组合式摸索是很重要的； 一个难以纯化的蛋白很可能在上游得到很好的解决。 * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * 蛋白表达概述 Michael Chao 常用蛋白表达系统(host) 原核细胞：大肠杆菌。 真核细胞：酵母、昆虫细胞、哺乳动物细胞 大肠杆菌表达系统 大肠杆菌是基因工程研究中采用最多的原核表达体系。 优越性： ①对大肠杆菌的基础生物学、分子遗传学等背景知识和基因表达的调控机理已有了深刻了解； ②商品化的载体和菌株种类非常齐全； ③表达效率高； ④易培养，成本低。 缺点： ①因分泌能力不足，真核蛋白质常形成不溶性的包含体； ②蛋白质不能糖基化； ③其内毒素很难除去。 酵母表达系统 甲醇酵母表达系统是目前应用最广泛的酵母表达系统，以Pichia Pastoris应用最多。 优越性： ①蛋白可糖基化，有相对正确的天然结构，可很好的生产分泌型蛋白； ②表达载体为整合型质粒，载体中含有与酵母染色体中同源的序列，因而比较容易整合入酵母染色体中，实现高效率表达； ③表达载体都为E.coli/Pichia Pastoris的穿梭载体，可在获得克隆后采用E.coli细胞大量 扩增。 ④易培养，成本低,可高密度发酵。 缺点： ①糖基化与哺乳动物有所差别； ②培养上清多糖浓度高，不利于纯化。 昆虫细胞表达系统 利用重组杆状病毒在昆虫细胞体系中表达外源蛋白是目前较为流行的表达方式。 优越性： ①重组蛋白具有完整的生物学功能，如蛋白的正确折叠、二硫键的搭配； ②可容纳较大片段的外源DNA插入，因此是表达大片段DNA的理想载体； ③可进行分泌表达。 缺点： ①糖基化与哺乳动物有所差别； ②表达量有限； ③作为药物宿主细胞未被FDA认可； ④培养成本高。 哺乳动物细胞表达系统 哺乳动物细胞常用于表达高活性的人源重组蛋白。 优越性： ①糖基化与人源蛋白一致； ②能表达天然结构的完整蛋白，活性很高； ③可进行分泌表达。 缺点： ①表达量低； ②培养成本很高，操作繁琐。 各种表达系统各有其优缺点，大肠杆菌和酵母表达系统蛋白表达水平高，生产成本低，但它们的加工修饰体系与昆虫细胞、哺乳动物细胞不完全相同；哺乳动物细胞产生的蛋白质更接近于天然蛋白质，但其表达量低、操作繁琐。 各种表达系统由于翻译后的加工不完全相同，因而产生的重组蛋白的生物学活性和免疫原性有时会有差别。因此，选择表达系统时，必须充分考虑各种因素，如所需要表达的蛋白是否有毒性，是否有活性，是否需要糖基化，还需要考虑成本、产量及纯化路线和安全性。 对于我们来说，最常用和最需掌握的是大肠杆菌表达系统 Factors in E.coli protein expression Strain vector growth conditions 一个蛋白要成功的在E.coli系统表达，就是要根据表达目的在载体，菌株和培养条件三个主要因素之间找到一个理想的结合点。以达到⑴目的基因的表达产量高;⑵表达产物稳定;⑶生物活性高;⑷表达产物容易分离纯化。 表达载体(Vector) 原核表达载体众多，常用的有pET(T7 promoter)、pQE(T5 promoter)、pGEX(GST融合表达)等。 各载体适应的菌株也不尽相同pET(BL21(DE3))、pQE(M15,JM109)、pGEX(BL21)。 对于我们来说，最常用和最需掌握的是pET表达系统 Expression plasmid features Induction of expression pET载体E.coli表达蛋白流程 pET sys