植物DNA、质粒DNA的提取以及载体构建.pptVIP

⑤载体本身的分子量都比较小，可容纳较大的外源基因片段。 ⑥载体在细胞内的拷贝数要高，方便外源基因在细胞内大量扩增。 ⑦载体在细胞内稳定性要高，保证重组体稳定传代而不易丢失。 ⑧载体的特征都是充分掌握的，包括它的全部核苷酸序列。 表达载体： 在克隆载体基础上，为使插入的外源DNA片段有效转录翻译成多肽，装有强化外源基因表达的强启动子以及利于表达产物分泌、分离和纯化的元件，这种载体称为表达载体。 表达载体构建的一般步骤： 酶切 连接 转大肠杆菌 PCR检测 重组质粒的提取 酶切检测 转化农杆菌 PCR检测 保菌 酶切： 1、确定酶切位点； 2、确定体系、缓冲液和酶的最佳反应温度； 3、配制反应液： buffer : 2 酶 ： 0.5 DNA ： 3 ddH2O : 补足20μ 连接： T4buffer ：1 DNA片段 ：6 Vector ： 2 T4连接酶 ： 1 配制好之后放连接仪16 ℃连接过夜。 转化大肠杆菌： 连接液加入感受态大肠杆菌 冰浴30min 42 ℃水浴热激90s 冰浴5min 加入400 预培养1h左右 涂平板 PCR检测： 挑取平板上的单菌落进行PCR检测。 酶切检测： 摇菌 提取质粒 酶切 电泳检测 转化农杆菌： 将重组质粒到感受态农杆菌中 冰浴30min 液氮速冻3min 37 ℃水浴5min 冰浴5min 加入400液体LB 预培养4h 涂平板 农杆菌PCR检测：挑菌 PCR 电泳 保菌： 甘油浓度15%—20%，混匀放-40 ℃保存 DNA和载体酶切 大肠杆菌菌落PCR和酶切检测 农杆菌菌落PCR 植物DNA、质粒DNA的提取以及载体构建 一、植物DNA的提取 1、目的和意义 2、原理 3、试剂的准备 4、操作过程 5、DNA检测 6、注意事项 7、常见问题及解决办法 1、目的和意义: 1、抗性苗的检测 2、分子杂交 3、分子标记 4、基因扩增 2、原理 : CTAB（十六烷基三甲基溴化铵hexadyltrimethyl ammomum bromide）是一种非离子去污剂，能溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使DNA游离出来。植物材料在 CTAB 的处理下，结合 65℃ 水浴使细胞裂解、蛋白质变性、 DNA 被释放出来。 CTAB 与核酸形成复合物，此复合物在高盐（0.7mM）浓度下可溶，并稳定存在，但在低盐浓度 （0.1-0.5 mM NaCl ）下 CTAB -核酸复合物就因溶解度降低而沉淀，而大部分的蛋白质及多糖等仍溶解于溶液中。经离心弃上清后，最后用75%的乙醇清洗沉淀，吹干，溶于TE中。 3、试剂的准备 试剂的全称： CTAB：十六烷基三甲基溴化铵 EDTA：已二胺四乙酸二钠 PVP : 聚乙烯吡咯烷酮。 试剂的配制（ 2×CTAB（100ml）） 2%CTAB：2g 1.4mol/LNaCl: 8.19g 20mmol/LEDTA: 4ml(0.5mol/L母液） 100mmol/L Tris·Cl(PH8.0): 10ml（1mol/L母液） 2%PVP: 2g 2% ?-巯基乙醇: 2ml 试剂的作用 Tris-HCl (pH8.0)：提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏 CTAB：溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离 EDTA：抑制DNase活性 β-巯基乙醇：抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐化，使酚类物质容易去除 PVP ：是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合物质，有效去除多酚，减少DNA中酚的污染；同时它也能和多糖结合，有效去除多糖。???? 4、操作过程（小样法） 1、将水浴锅打开，调到65度，并将裂解液放到水浴锅中预热； 2、挑取1-2g幼嫩的组织放到碾钵中，加入液氮迅速研磨成粉末； 3、将粉末迅速转入1.5ml的 离心管中，迅速加入裂解缓冲液，混匀，放入65度水浴锅水浴30min，期间晃动离心管2-3次； 4、将离