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门冬胰岛素结晶制备工艺的优化 　　摘要：目的 本文旨在优化门冬胰岛素的结晶制备方法，提高原料药收率，降低成本，提高门冬胰岛素的稳定性，为制剂生产提供优质原料。方法 在室温下通过对有机酸的种类、有机溶剂的浓度、盐的浓度以及pH，进行对比实验，通过显微镜图片分析和超高效液相色谱检测，优化门冬胰岛素的结晶制备方法。结果 研究发现有机酸宜选用1.0M的甘氨酸为最佳，同时采用体积分数15%的乙腈、体积分数为0.2%的苯酚、0.2M氯化钠溶液以及含 2.0～5.0g/L 重组门冬胰岛素，在初始pH为6.0的条件下加入醋酸锌组成的结晶液，经放大验证得到单斜针状晶体，形状规则均一，结晶收率可达99.0%以上。结论 通过以上实验表明，门冬胰岛素原料药的结晶方法符合生产要求，结晶收率良好，易于工业化生产，可为制剂提供优质的原料药。 　　关键词：门冬胰岛素；结晶方法；回收率 　　中图分类号：R977.6 文献标识码：A 文章编号 　　胰岛素都是治疗糖尿病最有效的药物，但普通胰岛素存在着作用时间短、吸收变异大、作用峰值明显、低血糖发生率高等诸多问题，正日益被胰岛素类似物所替代[1]。而重组门冬胰岛素作为一种速效胰岛素类似物，是利用基因工程DNA重组技术[2，3]将人胰岛素B链第28位的脯氨酸（Pro）替换为负电荷的门冬氨酸（Asp），利用电荷的排斥作用来阻止胰岛素单体或二聚体的自我聚合，使分子间的聚合减少。它不但能很好地模拟人胰岛素的分泌模式，控制血糖效果较好，而且由于其作用持续时间的缩短，不易与下餐前或者夜间胰岛素作用发生叠加，显著减少了低血糖的发生率[4]。 　　就目前技术而言，固态胰岛素中的晶体形式无论从贮藏性能还是后续制剂配方设计等方面都较液态形式方便。结晶制备得到的晶体具有均一稳定的固体分子形式，冻干时间短，样品稳定性高，因此它更适合工业化生产。通过相关查阅相关文献，发现基于人胰岛素和胰岛素类似物的结晶工艺方法很多[5]，但是制备高质量和高产量的重组门冬胰岛素结晶生产工艺国内外也未见相关报道。本课题主要为制备出高质量和高产量的重组门冬胰岛素-锌结晶，同时也可推进重组胰岛素原料药结晶的研究进展。 　　1 材料 　　重组门冬胰岛素（珠海联邦制药股份有限公司生物研究所，批号：L；甘氨酸（国药集团化学试剂有限公司）；乙酸锌、氢氧化铵（广东光华化学厂有限公司）；水饱和酚（北京拜尔迪生物科技公司）；乙酸、氯化钠（西陇化工股份有限公司）；盐酸（珠海市华成达化工有限公司）；乙腈（天津市康科德科技有限公司）；其余试剂均为分析纯。 　　梅特勒-托利多电子天平；北京佳源兴业科技脱色摇床；天津津腾微孔溶液过滤器；梅特勒-托利多PH计；凤凰光学显微镜（PH100）；Waters-Hclass超高效液相色谱仪。 　　2 方法和结果 　　门冬胰岛素和赖脯胰岛素都是单体胰岛素类似物，结构和作用方式有一定的相似性。重组赖脯胰岛素常用的结晶方法为：在1M乙酸体系下，含有1.8～2.5g/L重组赖脯胰岛素、100～300mg锌、0.15%～0.25%苯酚、pH5.9～6.2使其形成晶体[6]。本实验参考赖脯胰岛素的结晶方法，通过单因素对比实验优化门冬胰岛素的最佳结晶条件。 　　2.1有机酸体系的选择 制备九批30ml结晶体系，分别含1.0M乙酸3批、1.0M柠檬酸3批、1.0M甘氨酸3批，将门冬胰岛素制备液蛋白浓度稀释至2.5g/L，苯酚：体积分数含量为0.2%，将pH用氨水调至pH6.0，加入乙酸锌：200mg/L，恒温20～24℃搅拌10h，然后把温度调到2～8℃停止搅拌结晶10h。通过显微镜图片分析晶型效果，优化出最佳的有机酸。通过显微镜放大160倍观察，1.0M乙酸时为无定形沉淀，1.0M柠檬酸时为细小的无定形的晶体和沉淀共存，1.0M甘氨酸时为单斜针状晶体，均一性相对较好，而且针状晶体易碎。故选取1.0M的甘氨酸作为最佳的有机酸体系。 　　2.2有机溶剂选择 考虑到精纯后的门冬胰岛素本身就含有一定量乙腈，避免给原料引入其他杂质，故而选择乙腈作为有机溶剂。在2.1项下筛选出的有机酸体系下，加入体积分数含量为10%、15%、20%的乙腈。通过显微镜图片分析晶型效果，优化出合适的乙腈浓度。通过显微镜放大160倍观察，所有结晶的均一性都非常好，晶体形状规则，但10%乙腈、20%乙腈均没有15%乙腈的晶体宽度适合，且采用15%乙腈时晶体的形状、大小非常规则。故选取15%乙腈作为最佳的有机溶剂。 　　2.3 盐的选择 结晶液中盐可以提供过饱和度从而推进结晶的形成，在2.1项和2.2项已筛选的体系下分别加入的氯化钠，通过显微镜图片分析晶型效果，优化出合适的氯化钠浓度。通过显微镜放大64倍观察，0.1M氯化钠时结