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骨骼肌卫星细胞的原代、传代培养和鉴定 　　一、骨骼肌卫星细胞简介 　　骨骼肌卫星细胞最初被人们认为是骨骼肌的定向祖细胞，对骨骼肌的生长和伤后再生起重要作用。1961年，Mauro在对青蛙的胫前肌做研究时，利用电子显微镜，从肌膜和基底膜之间发现了骨骼肌卫星细胞。一般情况下，这些细胞处于静止状态，当骨骼肌受损、坏死或负荷过重等应激出现时，卫星细胞就能被激活，开始迁移至受损部位，然后增殖分化形成肌管，从而达到修复肌肉的目的。 　　二、骨骼肌卫星细胞的原代培养 　　取SD大鼠一只，使用10%浓度水合氯醛进行腹腔注射麻醉，其计量约为0.4ml/100g。静置大鼠数分钟直至其结膜反射消失，用镊子将其浸泡在75%酒精中消毒2-3分钟后，仰卧位固定，使用采血针吸除血液，提取腓肠肌和比目鱼肌，置入事先消毒并预冷的生理盐水中，然后迅速转移至超净工作台，取冰袋置于操作容器下方。 　　使用双抗PBS骨骼肌清洗液对获得的肌肉清洗3-4次，快速清除血管、肌筋膜以及脂肪等组织后，将肌肉均匀剪碎至1mm3 大小左右。再次加入骨骼肌清洗液清洗，静置后弃漂浮物。 　　将适量的II型胶原酶消化液（0.1%）加入被剪碎的肌肉中，使用37℃磁力搅拌机让肌肉均匀消化约60分钟，转移至离心管，以1000rpm离心10分钟，吸除上清液。根据沉淀体积加入适量的胰酶细胞消化液，磁力搅拌消化约20分钟，加入细胞种植液终止消化，将此时的肌肉悬液转移至离心管，以1000rpm离心10分钟，吸除上清液，在肌肉沉淀中加入10ml细胞种植液，均匀吹打成细胞悬液。将细胞悬液依次加入200目、400目的细胞筛中过滤纯化。均匀吹打滤液并接种于6孔细胞培养板中，置于培养箱（5%CO2，37℃，100%空气湿度）中培养2小时，细胞进行第一次差速贴壁后，将细胞液转移至新的6孔板中继续在培养箱（5%CO2，37℃，100%空气湿度）里培养2小时。然后将细胞悬液转移至提前用0.001%多聚赖氨酸工作液包被过的6孔板中。在细胞培养箱中培养48小时之后，使用细胞生长液进行首次换液并继续培养。之后每隔2天进行一次换液工作，观察并记录细胞的生长状况。 　　三、骨骼肌卫星细胞的传代培养 　　使用倒置相差显微镜观察细胞培养板中已贴壁细胞的覆盖率，若达到80%左右，则可进行传代培养。吸除培养板中的细胞生长液，加入PBS（0.0067M）清洗2次，吸除清洗用的PBS，每孔中加入适量预热至室温的胰酶细胞消化液，静置1-2分钟，并在倒置相差显微镜下观察，如果细胞收缩，细胞间隙增大并出现脱落的情况，立即吸除胰酶细胞消化液，往培养板中加入细胞生长液终止其消化，然后使用一次性吸管均匀吹打培养板底部未脱落的细胞，制成细胞悬液。加入三倍体积的细胞生长液稀释细胞悬液，并分装到新的培养板中，置细胞培养箱（5%CO2，37℃，100%空气湿度）中继续培养备用。 　　四、骨骼肌卫星细胞的活性检测方法――台盼蓝拒染法 　　正常的细胞的细胞膜结构是完整的，而死亡细胞的细胞膜结构是被破坏的。细胞膜结构一旦被破坏，它的通透性就会发生改变。台盼蓝可以穿透死亡细胞的细胞膜，渗透到细胞内部，从而与解体的DNA染色体结合，将死亡的细胞染成蓝色。正常细胞的细胞膜结构相对稳定，台盼蓝无法通过正常细胞的细胞膜，因而正常细胞不会被染色。台盼蓝拒染法可以快速区别正常细胞和死亡细胞，进而计算出细胞活性率。 　　操作步骤： 　　（1）取第一次传代培养的细胞悬液0.5ml，使用高糖DMEM稀释细胞密度至2×104个/ml。 　　（2）将调整好细胞密度的细胞液加入试管，再加入等容积的0.4%台盼蓝染色液，在常温下染色2-3分钟。 　　（3）用一次性吸管吸取混合染色液10l，注入已消毒并且擦拭干净的细胞计数板。 　　（4）计数500个细胞，蓝色细胞单个进行计数。 　　（5）结果分析：死细胞会被染成蓝色，而活细胞因拒染会呈现透明无色状。 　　（6）细胞活性率=（总细胞数-被染色细胞数）÷总细胞数× 100% 　　五、骨骼肌卫星细胞的纯度鉴定 　　（1）准备好有盖玻片的12孔板，盖玻片用多聚赖氨酸包被30分钟，然后取传代至第二代的细胞，以3×105 个/孔接种与12孔板内。将细胞培养板置于培养箱（5%CO2，37℃，100%空气湿度）中培养。 　　（2）将盖玻片取出，用PBS（0.0067M）漂洗3次。 　　（3）用4%多聚甲醛使细胞固定20分钟，PBS（0.0067M）漂洗3次，每三分钟一次。 　　（4）将盖玻片放入3%双氧水中室温浸泡30分钟，起到灭活内源性过氧化物的作用，PBS（0.0067M）漂洗3次，每三分钟一次。 　　（5）滴加5% BSA封闭液，在室温中孵育20分钟，将多余液体甩去。 　　（6）滴加1：100稀释