【2017年整理】蛋白质含量测定(微量)-专业实习1.docVIP

蛋白质的定量测定（微量）实践目的通过本实践培养学生的动手操作能力，主要实训分光光度计（可见光、紫外光）的操作，比色皿的选择及科学清洗方法，掌握蛋白质不同测定方式的方法考马斯亮蓝染料结合比色法测定原理考马斯亮蓝G-250是一种染料，在游离状态下呈红色，最大吸收峰在465nm。它能与蛋白质的疏水微区通过范德华力相结合，这种结合具有高敏感性，主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合，染料与蛋白质结合迅速，大约为2分钟，结合物的颜色在1小时内稳定，结合物为后变成深蓝色，最大吸收峰变为595nm。蛋白质含量在0.01-1.0mg/ml范围内，蛋白质-染料复合物在595nm处的吸光度与蛋白质含量成正比，符合比尔定律，可用比色法测定。蛋白质-染料复合物具有很高的吸光值，因此大大提高了蛋白质测定的灵敏度，最低检出量为1μg蛋白。一些阳离子[如K+，Na+，Mg2+，(NH4)SO4]和乙醇等物质不干扰测定，而大量的去污剂（如TrionX-100，SDS等）严重干扰测定，少量的去污剂可通过设计适当的对照实验而消除。由于本法操作简便，快速，灵敏度高，稳定性好，是一种测定蛋白质含量的常用方法。测定所需器材及试剂器材：722S分光光度计；试管；移液管；容量瓶；离心机；离心管；洗耳球试剂：1、标准蛋白质溶液：称取10mg牛血清白蛋白，溶于蒸馏水中并定容至100ml，制成100μg/ml的溶液。2、考马斯亮蓝G-250试剂：称取 100mg考马斯亮蓝G-250，溶于50ml 95％乙醇中，加入85% (m/v) 的磷酸100ml，最后用蒸馏水定容到1000ml。此溶液可在常温下放置一个月。该染液可保存数月，如果不用水稀释可长期保存，一般在使用前稀释。测定过程1、绘制标准曲线取6支干燥洁净的大试管，编号，按下表加入试剂。管号123456标准蛋白溶液（ml）0.00.81.0蒸馏水（ml）1.00.20.0考马斯亮蓝G-250试剂（ml）555555蛋白质含量（ug）020406080100A595nm上述试剂加完后，混匀，室温静置2min，以第1管为对照，在595nm处比色，读取各管吸光值，以牛血清白蛋白含量为横坐标，以吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。2、样品测定样品中蛋白质的提取称取新鲜绿豆芽下胚轴（或小麦叶片）0.5-1.0 g放入研钵中，加2ml蒸馏水研磨成匀浆，转入到离心管中，再用6ml蒸馏水分次洗涤研钵，洗涤液收集于同一离心管中，在室温（20-25℃2）样品中蛋白质含量的测定准确吸取1ml样品溶液于一支干燥洁净的试管中，加入考马斯亮蓝G-250试剂5ml，摇匀，室温静置2min，以标准曲线1号管为对照，在595nm处比色，记录吸光值。结果计算：样品中蛋白质含量（mg/g鲜质量）=（X*VT*N)/(W*VS*1000) =(X/VS*VT)/(1000*W)*NX：根据样品的吸光度所查的标准曲线值（蛋白质质量ug）VT：提取液总体积（ml）W：样品鲜质量（g）VS：测定时加样量（ml）N：稀释倍数【注意事项】在试剂加入后的5-20min内测定光吸收，因为在这段时间内颜色是最稳定的。测定中，蛋白-染料复合物会有少部分吸附于比色皿壁，测定完后用95%乙醇将蓝色的比色皿洗干净。由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此考马斯亮蓝染色法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差，在制作标准曲线时通常选用G-球蛋白为标准蛋白质，以减少这方面的偏差。考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量虽然干扰物质少，但仍有一些物质会干扰测定，主要的干扰物质有去污剂，如Triton-100、SDS；高浓度的Tris、EDTA、尿素、甘油、蔗糖、丙酮、硫酸铵等。缓冲液浓度过高改变测定液PH会影响显色。考马斯亮蓝染色能力很强，比色杯不洗干净会影响光吸收值，注意不可使用石英比色杯。紫外吸收法实践原理蛋白质分子中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，使蛋白质具有吸收紫外光的性质。吸收高峰在280nm处，其吸光度（即光密度值）与蛋白质含量成正比。此外，蛋白质溶液在238nm的光吸收值与肽键含量成正比。利用一定波长下，蛋白质溶液的光吸收值与蛋白质浓度的正比关系，可以进行蛋白质含量的测定。紫外吸收法简便、灵敏、快速，不消耗样品，测定后仍能回收使用。低浓度的盐，例如生化制备中常用的（NH4）2SO4等和大多数缓冲液不干扰测定。特别适用于柱层析洗脱液的快速连续检测，因为此时只需测定蛋白质浓度的变化，而不需知道其绝对值。此法的特点是测定蛋白质含量的准确度较差，干扰物质多，在用标准曲线法测定蛋白质含量时，对那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异大的蛋白质，有一定的误差。故该法适于用测定与标准蛋白