第七章 植物快速繁殖和脱毒--精.pptVIP

* 7.4.2 生物鉴定法（敏感植物鉴定法） indicator test plants ◆概念：有些植物对病毒极为敏感，一旦感染病毒就会在其叶片乃至全株上表现特有的病斑，把这种植物称为病毒敏感植物或指示植物。 * 每种病毒都有自已的敏感植物 如：马铃薯病毒的敏感植物有千日红、黄花烟、毛叶曼陀罗；大蒜病毒的敏感植物有黎、千日红；大丽花病毒的敏感植物为：矮牵牛、黄瓜；菊花病毒：矮牵牛、豇豆 。 * 从待测植物中取1－3g幼叶置于研钵中 磨成匀浆 吸取少量浆液擦抹指示植物叶片， 使浆液能浸入叶片表皮细胞 指示植物置于防蚜虫网罩的温室内 数周后观察 清水冲洗叶面 加入适量的0.1mol/L 磷酸缓冲溶液 ◆敏感植物鉴定病毒的方法 ①摩擦 接种法 * ②嫁接法 有些病毒不是通过汁液传播，而是通过专门的介体传播。如草莓黄化病毒、草毒丛枝病毒是通过一种特殊的蚜虫为介体进行传播。这种病毒的鉴定需将培养植株的芽嫁接在敏感植物上，根据敏感植物的病症表现来判断是否脱除了病毒。 * 原理： 7.4.3 抗血清鉴定法serologic test 当动物被病毒感染或人工注射异体蛋白质时 一种特异性丙种球蛋白称为免疫球蛋白 抗体在特殊细胞内形成，进入血液存在于血清和体液内。 这种含有特异性“抗体”的血清称为“抗血清”。 抗体 抗原 * * 如玻璃片凝集法：在清洁玻璃片的一端，用毛细管滴加5滴稀“抗血清”，另一端滴加等量对照血清。然后各加滴被检植物压榨出的原汁液两滴。用玻璃棒搅匀，在常温下静置20－50min，然后在40－60倍显微镜下观察。带病毒的叶绿体发生典型的凝集现象。 方法: * ① 具有高度的专化性。 ② 可诊断受感染而没有症状的带毒植物。 ③ 由于病毒与“抗血清”的“反应量”与病毒浓度成正比。 ◆抗血清鉴定法优点 * ①不是所有病毒都能制成抗血清，一般“黄化型”病毒，或严格由专化性昆虫传播的病毒。如马铃薯卷叶病毒极难或不能获得“抗血清”。 ②病毒在寄主体内含量太少，而提纯过程中丧失又太多。或者提纯过程中，病毒质粒丧失了必备的抗原结构。 ③植物体内具有单宁物质，单宁与病毒结合，使病毒丧失了抗原性质。 ◆抗血清鉴定法缺点 * 7.4.4 电子显微镜鉴定法 用电镜直接观察经脱毒培养的 叶片，检查是否有病毒质粒的 存在，还可以测量病毒颗粒的 大小、形状和结构。 透射电子显微镜 扫描电子显微镜 * 常采用的方法为吐水法和浸蘸法。 吐水法是在清晨用网架上的薄膜沾一些病株 吐水孔的积水，染色后就可直接放到 电镜下镜检。 浸蘸法是在网架薄膜上加1滴重蒸馏水，将 病株叶片或幼芽的新鲜切口在水滴中 浸几秒钟，吸去多余水分，再进行染 色，然后放到电镜下观察。 * 7.4.5 分子检测法 如RT-PCR（反转录PCR）法：将待测样品的总RNA与cDNA合成的试剂盒进行反应，合成cDNA，然后利用病毒DNA特有的序列设计引物进行PCR反应，即可知道在寄主中是否有病毒基因的存在及表达。 * PCR 琼脂糖凝胶电泳 最终产物 紫外光观察 3-4 小时 * 7.5 脱毒后防病毒再感染 * 7.5.1 无病毒苗的隔离保存 通常无病毒苗原种要在隔离区，如海岛、山地、新区等利用自然环境进行隔离种植保存，或采用隔虫网室种植保存。种植圃的土壤也应该进行消毒，保证原种是在与病毒严密隔离的条件栽培，并采用最优良的栽培技术措施。同时要及时和定时对原种进行病毒的检测和测定。可以保存利用5—10年 。 * 针对病毒感染途径提出对应措施： ① 昆虫传染病毒，特别是蚜虫： 300目，孔径0.4-0.5mm。 ② 土壤传染病毒（真菌和线虫为媒介）： 土壤要消毒，环境要整洁，及时打药。 ③ 接触传染病毒：贮存、运输和播种；工 具、衣服接触等。 * 7.5.2 无病毒苗的长期保存 种苗经鉴定后，选择无病原种株系，回接于试管内，长期保存无病毒原种。 方法： ① 培养基中加生长延缓剂：B9或矮壮剂，弱 光、低温、继代1次/2-3月。? ② 低温保存：试管苗2cm，4℃，暗培养，可 保存1年左右。 ③ 超低温保存： -196℃，可长期保存。 * 本章要点 本节课我们学习了植物快速繁殖的概念、方法和步骤；植物病毒的特点、传染途径、运输方式和对植物的危害性；茎尖培养脱除病毒的原理、获得无特定病毒苗的程序和注意事项及其鉴定方法。 本章内容主要掌握以下几点问题： 1.掌握植物快速繁殖的途径和方法。 2.掌握植物快速繁殖中茎尖培养脱毒原理和步骤。 3.知道茎尖以外其他途径脱毒的优缺点。 4.理解脱毒苗的常用鉴定方