TNF―α预处理脐血间充质干细胞移植心肌梗死大鼠心功能影响.docVIP

TNF―α预处理脐血间充质干细胞移植心肌梗死大鼠心功能影响 　　[摘 要] 目的：研究肿瘤坏死因子（TNF-α）预处理的脐血间充质干细胞（HUMSC）血管细胞黏附分子-1的表达及其对心肌梗死大鼠心功能的影响。方法：实验组取第3代HUMSC用TNF-α（10 ng/mL）预处理24 h后，迁移黏附实验检测其体外迁移黏附能力，Western blot检测VCAM-1蛋白表达；对照组不用TNF-α处理。动物实验分为实验组（注射TNF-α预处理HUMSC）和对照组（注射HUMSC），取第3代HUMSC移植于心肌梗死大鼠的心肌内3周后，二维超声心动图检测大鼠左心室心功能。结果：与对照组比较，实验组体外迁移黏附力明显增强（P0.05）；黏附分子VCAM-1的蛋白表达水平显著升高（P0.05）；左心室射血分数明显提高（P0.05）。结论：移植TNF-α预处理的HUMSC更能明显改善大鼠心功能，其机制可能与TNF-α提高HUMSC黏附分子VCAM-1的蛋白表达水平相关。 　　[关键词] 肿瘤坏死因子-α；脐血间充质干细胞；黏附分子 　　中图分类号： R332 文献标识码： A 文章编号：2095-5200（2015）04-004-05 　　每年全球约有1700万人死于心血管病，其中占总数1/2患者死于急性心肌梗死（AMI）[1]。过去30年中，MI病死率（30 d内）虽然已降至10% ，但年病死率仍为20% 左右[2]。目前，MI治疗方法以药物、介入和外科手术为主，这些方法可解除血管阻塞，缓解心室重构，延缓和改善心功能恶化及心律失常发生，但无法逆转坏死心肌，使已梗死心肌细胞再生。而干细胞治疗给人们带来了新希望。 　　MSC具有多向分化潜能、支持和促进造血干细胞植入、调节免疫以及分离、培养时操作简便等特点[3]。脐血间充质干细胞（Human Umbilical cord blood mesenchymal stem cells，HUMSC）是从脐带组织中分离出来，较祖细胞更原始，有更强增殖分化能力[4]；免疫原性较为幼稚，不易触发免疫反应或引起移植物抗宿主病；较骨髓MSC有更大应用潜能。 　　循环血液中干细胞归巢到缺血组织中是组织修复第一步，干细胞归巢第一步就是黏附于心脏微血管内皮细胞[5]，因此提高移植干细胞向受损组织迁移及定植对提高干细胞治疗效果具有重要价值。黏附分子广泛存在于细胞表面及细胞外基质中，通过与受体结合，介导细胞与细胞或细胞与细胞外基质接触，并参与细胞活化与迁移[6]。在炎症、缺血性损伤及伤口愈合等过程中发挥重要作用。生理状态下充质干细胞少量表达血管细胞黏附分子-1（vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1），而明显表达细胞间黏附分子（intercellular adhesion molecule-1，ICAM）[7]。Segers等[8] 研究发现，VCAM-1对BMMSCs黏附于心肌微血管内皮细胞具有重要作用，在加入VCAM-1抗体后可完全消除由肿瘤坏死因子 （tumor necrosisfactor，TNF-α）预处理增强MSC对内皮细胞黏附性，而加入ICAM-1抗体则MSC对内皮细胞黏附能力却没有明显变化。所以本研究用采用TNF-α预处理HUMSC，通过迁移黏附能力、VCAM-1表达和左心室功能变化等检测指标，探讨其对心肌梗死大鼠治疗作用。 　　1 材料与方法 　　1.1 实验动物 　　雄性SD大鼠20只，清洁级，220～250 g用于心肌梗死造模，购自河南省实验动物中心，实验中对动物处置符合动物伦理学要求。 　　1.2 主要试剂和仪器 　　L-DMEM、胎牛血清（fetalbovine serum，FBS）购自美国Hyclone公司；0.25%胰酶、SDS凝胶试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司；TNF-α购自美国Peprotech公司；PVDF膜购自美国Sigma公司；VCAM-1一抗购自美国Bioworld公司；β-actin、二抗购自北京中杉金桥生物技术有限公司；倒置显微镜Olympus BX41购自日本Olympus公司；二维多普勒超声仪购自美国Phillips公司。 　　1.3 脐血间充质干细胞分离和培养 　　脐血来自于郑州市妇幼保健医院产妇志愿捐献足月妊娠顺产婴儿，参照文献[9]采用密度梯度离心法获取HUMSC，将分离细胞以5×106/mL接种于含体积分数为20%胎牛血清DMEM/F12培养液中培养。取第3代细胞用于后续实验。 　　1.4 细胞鉴定 　　将第3代HUMSC调整为1×106 /L 细胞悬液，用流式细胞仪进行细胞表面标志测定。细胞分别与鼠抗人FITC-CD90、PE-CD86、FlTC-CD45，PE-CD19、FIT